狂犬病毒pVax－G／N融合基因的克隆及其在釀酒酵母中的表達＊

王 政，王小英，馬文麗，李孟森

狂犬病是一種嚴重威脅人類和動物健康的重要人獸共患病，至今無有效地治療藥物，一旦發病即引起100%的死亡。近年來，我國狂犬病疫情一直呈上升趨勢，病死數據居我國37種法定報告傳染病之首［1］。

為了預防狂犬病并研制高效安全的狂犬病疫苗，人們不斷地進行研究和探索，Tao L等利用反向遺傳學把兩組狂犬病毒糖蛋白（G）基因通過雞胚傳代得到滅活的狂犬病毒疫苗［2］。口服疫苗是研究的新領域，即利用消化道吸收含有治療性的核酸，經消化道到達特定部位分泌出治療性蛋白，發揮治療功能，從而達到防治狂犬病的作用。

目前研究狂犬病毒某個蛋白的表達情況較多是大腸桿菌表達系統。大腸桿菌表達系統雖然表達量高，但具有致病性，不適合用于藥物研發。相比之下，釀酒酵母作為真核表達系統卻具備有安全無致病性，易遺傳操作、有良好的蛋白分泌能力、有類似高等生物的蛋白質翻譯后的修飾功能、培養條件簡單、易進行高密度發酵等優點［3］，成為一種良好的藥物蛋白表達載體。此外，釀酒酵母特殊的細胞壁結構，對消化道的胃酸有較強的抵抗作用，是一種天然的生物膠囊，能為生物大分子提供良好的保護，同時釀酒酵母細胞壁所含有的成分可調節腸胃功能，增強機體免疫能力，是一種良好的保健食品來源［4］。由此可見釀酒酵母完全有可能作為外源物質的天然緩釋包裹物，在消化道給藥過程中起長效作用。

本研究以釀酒酵母為微生物輸送載體，以狂犬病毒核蛋白（N）和糖蛋白（G）為實驗對象，通過連接核蛋白和糖蛋白，并構建分泌型表達載體，表達出具有免疫原性的蛋白，為今后的口服疫苗提供依據。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 SAD－B19弱毒株編碼GP和NP的基因（質粒pVax－G）由軍事醫學科學院軍事獸醫研究所扈榮良博士惠贈；釀酒酵母INVScI、酵母表達載體pYes2由南方基因研究所惠贈；E．coli的DH5α由本實驗室保存。ExTaq酶pMD－18T載體和EcoRI、PstI、XbaI、NheI等限制性核酸內切酶購自Takara（大連）公司。T4DNA連接酶購自Promege公司，DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA Ladder購于北京天根生化科技有限公司?？袢〔《镜男∈髥慰寺】贵w（1C5）購自Abcam；羊抗鼠IgG購自Bioworld。

1．2 實驗方法

1．2．1 pMD18－T／G／N融合基因克隆質粒的構建

1．2．1．1 PCR 擴增 G／N 基因片段：根據 Sambrook［5］等試驗設計及操作方法，確定PCR擴增反應體系及條件。PCR法從質粒pVax－G中擴增狂犬病病毒G基因。上游引物為5′－CCGGAATTCATGGTTCCTCAGGCTCTC－3′（下劃線部分為EcoRI酶 切 位 點 ），下 游 引 物5′－GGCCTGCAGCAGTCTGGTCTCACCCCCACTCTTG－3′（下劃線部分為PstI酶切位點），反應體積50μL，30個循環：94℃90s，58℃90s，72℃120s。目的片段以EcoRI、PstI酶切回收純化備用。PCR法從質粒pVax－G中擴增狂犬病病毒N基因。上游引物為5′－GCCCTGCAGGATGCCGACAAGATTGTATTC－3′（下劃線部分為PstI酶切位點），下游引物5′－TGCTCTAGATTATGAGTCACTCGAATA TGTCT－3′（下劃線部分為XbaI酶切位點），反應體積50μL，30個循環：94℃90s，58℃90s，72℃120s。目的片段以PstI、XbaI酶切回收純化備用。

1．2．1．2 線 性 pMD18－T 的 制 備 克 隆 質 粒pMD18－T以EcoRI和XbaI酶切，回收線性載體片段。

1．2．1．3 融合基因的制備 將PCR擴增的G、N基因酶切后的回收產物，在T4DNA連接酶的作用下融合，回收融合片段。

1．2．1．4 融合片段與克隆質粒pMD18－T 連接將融合片段與pMD18－T載體在16℃條件下過夜連接，獲得克隆質粒。反應體積10μL（融合片段7μL，pMD18－T 1μL，T4DNA 連接酶1μL，10×T4DNA連接酶緩沖液1μL）常規CaCl2法轉化大腸桿菌DH5α感受態，以氨芐抗性篩選，菌落酶切鑒定重組陽性克隆，將鑒定正確的克隆各送3個至北京天根公司測序，抽提構建成功的克隆質粒。

1．2．2 融合基因分泌表達載體的構建

1．2．2．1 融合基因片段的獲取 取克隆成功的pMT－G／N融合基因克隆質粒，以EcoRI和XbaI酶切，回收G／N融合基因。

1．2．2．2 線性分泌表達載體的制備 表達載體pYes2以EcoRI和XbaI酶切，回收線性表達載體。將融合基因片段與分泌表達載體pYes2 16℃連接過夜。獲得成功連接融合基因的分泌表達質粒。反應體積10μL（融合片段7μL，pYes2 1μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNA連接酶緩沖液1μL），鑒定方法如1．2．1．4；抽提構建成功的攜帶融合基因的分泌表達質粒pYes2－G／N。

1．2．3 pYes2－pVax－G／N 質粒轉化釀酒酵母 常規醋酸鋰法轉化釀酒酵母INVSc1，尿嘧啶營養缺陷型（SC－U）培養基初次篩選，提取經初次篩選的陽性克隆酵母質粒，PCR鑒定為陽性重組酵母。

1．2．4 pYes2－pVax－G／N 在釀酒酵母中的誘導表達 將酵母陽性克隆轉接至15mL液體SC－U培養基（含2%的葡糖糖）中，30℃過夜培養，測OD600＝2．2，取10mL培養物4℃3 000r／m離心5min，去上清，加1mL SC誘導培養基（含2%半乳糖）重懸菌體，并轉移至50mL誘導培養基中，使最終OD600約為0．4，30℃誘導培養12h，取10mL菌液，高速離心，收集上清，至上清中加入5倍體積預冷丙酮，靜置1h，4℃離心，去上清，往沉淀中加入7mol／L鹽酸胍0．5mL復性30min，分裝，－80℃保存備用于SDS－PAGE電泳。

1．2．5 Western－blot分析 以12%分離膠進行SDS－PAGE電泳，以誘導前菌株為陰性對照，狂犬病病毒的小鼠單克隆抗體（1C5）1∶2 000和辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG 1∶5 000進行 Westernblot分析。

2 結 果

2．1 G和N基因的PCR擴增結果從質粒pVax－G中PCR擴增出G、N基因，1%瓊脂糖凝膠電泳，以DGL500為Marker，得到位于1 000～2 000之間的G、N兩條目的帶，G基因的片段為1 518bp，N基因片段為1 353bp，見圖1。

圖1 G、N基因的PCR結果1：G基因；2：N基因；M：DNA markerFig．1 PCR detection on the existence of G and N genes1：G gene；2：N gene；M：DNA Marker．

2．2 G和N基因的融合 將G、N基因PCR擴增產物用PstI內切酶酶切4h，DNA膠回收后，相同濃度等量加入到反應體系中，以T4DNA連接酶16℃連接過夜，以1kb為Marker，連接產物電泳，在2 928bp處存在一條預期的條帶，如圖2。

圖2 PCR檢測狂犬病病毒G／N融合基因酶切電泳圖Fig．2 Result of PCR production of G／N gene digested by endoenzymeM：DNA Marker；1：G／N fused gene．

2．3 融合片段與與克隆質粒pMD18－T連接 將融合片段與pMD18－T載體在16℃條件下過夜連接，獲得克隆質粒，并轉化感受態細胞，挑取3個菌落以內切酶EcoRI、XbaI和NheI酶切鑒定，并送至測序公司進行測序。酶切如圖3。

2．4 pYes2－pVax－G／N 質粒載體的鑒定 pYes2與pVax－G／N融合基因連接轉化大腸桿菌，以擴增G／N融合基因的引物進行PCR鑒定，電泳結果中出現2871bp的特異性條帶即為目的基因，對應菌落即為陽性克隆，如圖4，陽性克隆提取質粒測序結果與理論值完全相符。

2．5 酵母陽性克隆子的鑒定 pYes2－pVax－G／N質粒轉化釀酒酵母，SC－U培養基篩選出陽性克隆，提取該陽性酵母克隆質粒，PCR進一步鑒定，如圖5。

2．6 pYes2－pVax－G／N 質粒誘導的表達結果 收集上清液，經變性復性處理后，SDS－PAGE鑒定重組釀酒酵母菌株的誘導表達，結果在約110kD處有一條與對照不同的條帶出現，但該條帶是否為目標蛋白，能否與狂犬病病毒單克隆抗體發生特異性反應還需通過 Western－blot進一步鑒定確定，如圖6A；Western－blot分析結果顯示，經誘導后表達的上清液約在110kD處有一特異性條帶，據此可判定狂犬病毒pYes2－pVax－G／N融合基因在釀酒酵母中獲得分泌表達，且目標蛋白具有良好的抗原性，如圖6B。

3 討 論

據2008年世界衛生組織統計全球約有五萬五千人死于狂犬?。?］，而全球約有一千萬狂犬病疫苗用于暴露后治療，其中約48%的疫苗仍然來源于具有潛在危險的腦組織減毒疫苗。

狂犬病病毒（Rabies virus，Rv）屬彈狀病毒科狂犬病病毒屬，其基因組為12kb的單股負鏈RNA，編碼5種主要結構蛋白，即核蛋白（N）、轉錄酶蛋白（L）、基質蛋白（M）、磷酸化蛋白（NS）和糖蛋白（G）［7］。其中糖蛋白（GP）和核蛋白（NP）是Rv可誘導機體產生保護性免疫反應的兩種主要蛋白質。GP可刺激機體產生相應的中和抗體［8］，NP與抗狂犬病病毒的免疫識別和記憶有關，NP可以激活B細胞的抗體反應，誘發補體結合抗體，促進中和抗體產生，抑制病毒在細胞間的傳播和在細胞內繁殖。據研究發現，NP與抗狂犬病病毒的免疫識別和記憶有關。在以GP為目的抗原進行抗狂犬病的研究中，發現GP是Rv當中重要的一種抗原蛋白，具有6個～7個抗原表位，其中Ⅱ和III是重要的抗原表位［9］Tomar NR等［10］為了研究表位疫苗預防狂犬病，利用巨細胞病毒表達狂犬病毒GP，并利用免疫印跡和間接免疫熒光技術等方法預測其抗原表位。

在研究狂犬病疫苗領域，表達抗原性蛋白最初用大腸桿菌表達系統。該表達系統雖然表達產量高，但原核表達系統不具有修飾功能，且表達產物具有致病性，所以不適合用于藥物研發。后來Osorio等和Henderson等分別在痘苗病毒和腺病毒中表達抗原性蛋白，雖然能夠誘發機體產生中和抗體，但是這兩種病毒作為載體的同時存在潛在的致病性［11］。相比之下，釀酒酵母作為真核表達系統卻具備有安全無致病性，易遺傳操作、有良好的蛋白分泌能力、有類似高等生物的蛋白質翻譯后的修飾功能、培養條件簡單、易進行高密度發酵等優點［3］，成為一種良好的藥物蛋白表達載體。同時作為口服疫苗的輸送載體，釀酒酵母細胞具有獨特的優點，其細胞外層為甘露聚糖，中間層為蛋白質分子，內層為葡聚糖，因此該酵母對消化道的胃酸作用具有較強的抵抗作用，是一種天然的生物膠囊。它具備其他微生物所不具有的優勢［12］，如增強免疫能力，具有抗輻射、抗腫瘤、抗炎和調節胃腸功能的作用。由此可見，釀酒酵母是一種很好的藥物表達載體。

糖蛋白（GP）和核蛋白（NP）是Rv可誘導機體產生保護性免疫反應的兩種主要蛋白質。為了研制高效、安全的狂犬病疫苗，本研究通過基因工程方法將編碼GP和NP的狂犬病病毒基因進行融合，構建狂犬病糖／核蛋白融合基因真核表達載體，利用釀酒酵母表達目的蛋白，最后通過SDS－PAGE和Western－blot驗證表達結果，發現誘導先后的蛋白表達有一條明顯差異條帶，約110kD。由此可知，已經成功構建狂犬病病毒糖蛋白及核蛋白的融合表達體系，并成功分泌出目的蛋白，且具有良好的抗原性。

本實驗采用釀酒酵母表達狂犬病病毒蛋白，在結構和功能上更接近天然蛋白，具有較好的抗原性，另外利用釀酒酵母作為載體不會對人和動物產生危害，生產和使用過程安全，可以大批量的生產抗原。通過上述的研究，為后續的口服狂犬病疫苗的制備和應用提供充足的理論依據和研究條件。

［1］Nigg AJ，Walker PL．Overview，prevention，and treatment of rabies［J］．Pharmacotherapy，2009，29（10）：1182－1195．DOI：10．1592／phco．29．10．1182

［2］Tao L，Ge J．Generation of a recombinant rabies Flury LEP virus carrying an additional G gene creates an improved seed virus for inactivated vaccine production［J］．Virol J，2011，8（1）：454．DOI：10．1186／1743－422X－8－454

［3］Nielsen J，Jewett MC．Impact of systems biology on metabolic engineering ofSaccharomycescerevisiae［J］．FEMS Yeast Res，2008，8（1）：122－131．DOI：10．1111／j．1567－1364．2007．00302．x

［4］Steidler L，Hans W，Schotte L，et al．Treatment of murine colitis byLactococcuslactissecreting Interleukin－10［J］．Science，2000，289（5483）：1311－1312．DOI：10．1126／science．289．5483．1352

［5］Sambrook J，Russell DW．Molecular cloning：A laboratory manual［M］．2001，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，607－610．

［6］Manning SE，Rupprecht CE，Fishbein D，et al．Human rabies prevention－United States，2008：recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices［J］．MMWR Recomm Rep，2008，57（RR－3）：1－28．

［7］Yuan HJ，Hu RL，Zhang SF，et al．Cloning，sequencing and expression of N gene of rabies virus subclione strain SRV9［J］．Chin J Prev Vet Med，2003，25（1）：5－8．DOI：cnki：ISSN：1008－0589．0．2003－01－001．（in Chinese）．袁慧君，扈榮良．狂犬病病毒SRV9克隆株核蛋白基因的克隆表達與特性分析［J］。中國預防獸醫學報，2003，25（1）：5－8．

［8］Faber M，Faber ML，Papaneri A，et al．A single amino acid hange in rabies virus glycoprotein increases virus spread and enhances virus pathogenicity［J］．J Virol，2005，79（22）：14141－14148．DOI：10．1128／JVI．79．22．14141－14148．2005

［9］Houimel M，Dellagi K．Peptide mimotopes of rabies virus glycoprotein with immunogenic activity［J］．Vaccine，2009，27（34）：4648－4655．DOI：10．1016／j．vaccine．2009．05．055

［10］Tomar NR，Chandra R．Expression of rabies virus glycoprotein gene into eukaryotic system and determination of potential T－cell epitopes［J］．Indian J Exp Biol，2011，49（8）：584－589．

［11］Henderson H，Jackson F，Bean K，et al．Oral immunization of raccoons and skunks with a canine adenovirus recombinant rabies vaccine［J］．Vaccine，2009，27（51）：7194－7194．DOI：10．1016／j．vaccine．2009．09．030

［12］Zhao LJ，Song XP，Li FY．Research progress on anti－oxidation ofPolysaccharideand its derivatives［J］．J Shanghai Uni Eng Sci，2008，22（1）：44－47．DOI：CNKI：SUN：SGCJ．0．2008－01－012（in Chinese）趙琳靜，宋小平，黎方雅．多糖及其衍生物抗氧化性質的研究進展［J］．上海工程技術大學學報，2008，22（1）：44－47．