牛隱孢子蟲多重PCR方法的建立及應用

彭 昊，李 軍，陶 立，陳澤祥，韋志鋒，許力干，楊 威

隱孢子蟲病（cryptosporidiosis）是由隱孢子蟲感染而引起的以腹瀉為主要臨床癥狀的一種人獸共患的寄生蟲病［1］。隱孢子蟲主要引起幼齡動物的消化道和呼吸道疾病，導致其生產性能下降或死亡。傳統方法如糞便濃集、改良抗酸染色和免疫熒光染色法等檢測卵囊步驟繁瑣，敏感性低，目前使用的分子生物學方法檢測隱孢子蟲方法為Xiao等［2］建立的巢式－PCR－RFLP，特點是通用性好，可檢測目前發現的所有隱孢子蟲種類，但需要兩輪PCR以及酶切鑒定的過程方能定種，較為耗時。本研究在國外牛微小隱孢子蟲COWP基因［3］和本室安氏隱孢子蟲ITS－1基因單一PCR技術的基礎上，建立多重PCR的檢測方法，優化適宜條件，建立多重PCR快速檢測方法。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 蟲株 安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲由本實驗室分離鑒定，微小隱孢子蟲為河南農業大學張龍現教授惠贈；牛泰勒氏蟲、牛巴貝斯蟲、伊氏錐蟲、食道口線蟲為廣西大學寄生蟲研究室李健老師惠贈。

1．1．2 試劑 糞便DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker 1購自廣東東盛生物科技有限公司。

1．2 方法

1．2．1 引物的設計與合成 根據前人研究及本室研究情況，設計合成兩對引物，引物序列為引物由廣州Invitrogen公司合成。微小隱孢子蟲引物靶基因為COWP基因，引物序列為：上游引物 C．parvum P1：5′－CCCAACATTCCTGGTGTAGCTTCC －3′，下游引物 C．parvum P2：5′－GAA CGCACCTGTTCCCACTCAATG－3′，預期擴增片段長度為1 033bp。安氏隱孢子蟲引物靶基因為ITS－1基因，上游引物 C．andersoni P1：5′－ATTGAACCTGAACTTGCCTA －3′，下 游 引 物 C．andersoni P2：5′ – AAAAGTCGGCAAATAACAA－3′，預計擴增片段長度為263bp。

1．2．2 DNA模板的制備 取待檢牛的新鮮糞便20．0g～50．0g，置滅菌燒杯充分攪勻，稱取攪拌后的糞便樣本180～220mg至2mL離心管中，反復凍融處理3次后，按糞便基因組DNA提取說明書提取模板DNA。

1．2．3 多重PCR擴增條件的優化 在微小隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲單重PCR穩定的基礎上，將微小隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲的DNA等量混勻物作為模板，對多重PCR中的退火溫度（55℃（下同）、57、59、61、63）、引物濃度（50pmol／50pmol、50pmol／25pmol、25pmol／25pmol、25pmol／50 pmol）等條件進行優化，篩選多重PCR擴增的最佳反應體系和程序。

1．2．4 特異性試驗 分別用分別以經傳統鏡檢及Nest－PCR－RFLP鑒定后定種確定的微小隱孢子蟲與安氏隱孢子蟲混合物、微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲、牛泰勒氏蟲、牛巴貝斯蟲、伊氏錐蟲、食道口線蟲為模板，進行PCR擴增檢測，PCR反應結束后取20μL產物用于1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1．2．5 敏感性試驗 測定敏感度時，將經過計數的微小隱孢子蟲與安氏隱孢子蟲混合卵囊加入牛糞中，濃度分別為5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5個卵囊／g糞，用天根糞便基因組DNA試劑盒分別提取DNA后，進行多重PCR擴增。

1．2．6 重復性試驗 應用建立的多重PCR方法，重復檢測微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲單一DNA或混合DNA樣品3次，以確定其穩定性。

1．2．7 多重PCR對臨床樣品的檢測 采用多重PCR方法對采自廣西不同地區一些規模化奶牛場及散養戶的1613份牛糞樣進行牛隱孢子蟲流行病學調查，并與經典的巢式PCR方法進行比較分析。

2 結 果

2．1 多重PCR條件的確立 按照對 Multi－PCR反應的退火溫度，見圖1、引物濃度，見圖2。

2．2 Multi－PCR反應特異性檢測結果 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，見圖3，微小隱孢子蟲與安氏隱孢子蟲混合物、微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲均擴增出相應特征性的片段，而貝氏隱孢子蟲、牛泰勒氏蟲、牛巴貝斯蟲、伊氏錐蟲、食道口線蟲無特征性條帶，證實本方法有良好的特異性。

2．3 Multi－PCR反應敏感性檢測結果 通過對7個不同濃度的隱孢子蟲模板進行擴增，結果表明本方法在5×102個／g孔處仍可見清晰度較高的目的條帶，見圖4。所以本方法最低可檢測每g牛糞中500個隱孢子蟲卵囊。

2．4 重復性試驗 應用建立的多重PCR方法，重復檢測微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲單一DNA或混合DNA樣品3次，結果均一致。

2．5 多重PCR對臨床樣品的檢測 采用多重PCR方法對采自廣西不同地區一些規模化奶牛場及散養戶的1 613份牛糞樣進行牛隱孢子蟲多重PCR方法與經典的巢式PCR方法的平行比較分析。。兩種方法檢測結果均為安氏隱孢子蟲陽性糞樣189份，微小隱孢子蟲陽性糞樣1份，符合率為100%。表明建立的多重PCR方法特異性和敏感性較好，可用于臨床檢測。

3 討 論

常規隱孢子蟲病原學檢測主要通過小腸黏膜活檢法、糞便集卵法及抗酸染色法等鏡檢觀察，均需要進行隱孢子蟲的純化，費時費力、檢出率低且主觀性強。而采用分子生物學方法檢測往往也要先進行隱孢子蟲的分離純化、超聲破碎等前處理過程，而本研究通過直接用試劑盒，僅凍融處理即可快速、簡便提取糞便中的隱孢子蟲卵囊DNA做為模板，較前人方法［4］省略了從糞便中卵囊分離、純化的繁瑣步驟，大為減輕了工作量。

單一PCR 1次只能檢測一種病原，當對幾種病原進行檢測時，需進行多次PCR反應。而多重PCR技術具有單一PCR技術無可比擬的優越性：方便快捷和經濟，減輕了工作量，一次反應可以檢測多個基因型，可最大限度減少取樣錯誤和交叉污染。具體到隱孢子蟲的檢測方面。相較Xiao等［2］建立的通過兩輪PCR擴增隱孢子蟲18SrRNA特異性DNA片段后再選取不同的限制性內切酶進行RFLP鑒定該隱孢子蟲蟲種的經典方法，本研究建立的多重PCR方法能在一次反應中對糞樣中的微小隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲進行檢測，而敏感性方面與向飛宇［5］、Benigno［6］等報道應用經典方法最低檢測500個卵囊的水平相當，證實本方法特異、敏感、快速、簡便，具有良好的應用性。

當然，經典方法經過不斷改進可以用于區分幾乎所有的隱孢子蟲種類，在種的鑒別和基因型分型方面仍然具有不可替代的優勢。近來國外雖有Santin［7］等多重PCR方法鑒別微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲／賴氏隱孢子蟲的報道，但該方法檢測微小隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲的目的條帶差異僅為50bp（微小隱孢子蟲為400bp，安氏隱孢子蟲目的條帶350bp）因此在電泳鑒定時對所用Maker、瓊脂糖及結果辨識區分能力上均有較高要求，且牛隱孢子蟲和賴氏隱孢子蟲被認為并不導致宿主產生疾病或影響其生理［8－9］，臨床鑒定意義相對較低。本研究針對公共衛生學意義和臨床危害較嚴重的微小隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲，針對性和實用性較高。

應用建立的多重PCR方法對采自廣西不同地區一些規模化奶牛場及散養戶的1 613份牛糞樣進行牛隱孢子蟲流行病學調查并與巢式－PCR－RFLP方法做平行比較，兩種方法檢出的結果吻合。此次調查發現主要流行蟲種為安氏隱孢子蟲，微小隱孢子很少。究其原因主要是微小隱孢子蟲主要感染斷奶前乳牛，而此次調查主要為斷奶后乳牛，此時的優勢蟲種應為安氏隱孢子蟲，與Kvác等人［10］的研究情況相似，也進一步證實了隱孢子蟲種類與日齡緊密相關。多重PCR方法的臨床使用效果表明，本方法可用于隱孢子蟲的流行病學調查研究及臨床診斷。

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