糞腸球菌TLME3株AceA基因的克隆和序列分析＊

聶 鑫，高 原

糞腸球菌是一種新的人獸共患病病原體［1］，它不但是引起醫院內病人感染和死亡的主要致病菌［2］，而且動物感染糞腸球菌發病和死亡的報道也越來越多［3］。豬源糞腸球菌毒力島基因與人源相關基因、致羔羊腦炎糞腸球菌毒力因子基因片段與醫學臨床中某些該菌的相關基因片段同源性很高，存在著基因水平轉移或某種聯系［4－5］。糞腸球菌感染致死主要由其毒力因子所致。在糞腸球菌感染過程中，是由Ace介導黏附在宿主細胞外基質（ECM）蛋白上，完成定植和感染第一步的［6］。因此，Ace是糞腸球菌感染的最重要的毒力因子之一。

1 材料與方法

1．1 菌株與載體 所用糞腸球菌TLME3株為本實驗室從發生敗血癥的雛鵝體內分離并鑒定；E．coliDH5α為本實驗室保存；pMD18－T克隆載體購于大連Takara公司。

1．2 工具酶及試劑Taq酶購自Promega公司，限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、Proteinase K購于大連Takara公司，dNTPs、DNA DL2 000Marker、DNA DL10 000Marker、Solarbio凝膠回收試劑盒購自上海Solarbio生物科技公司，北京莊盟質粒小量抽提試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。其它化學試劑為國產分析純產品。

1．3 引物設計與合成 根據GenBank上已發表的糞腸球菌B－343／TX2783株（注冊號為 AF260896）的 AceA基因序列，用Primer Premier 5．6．0和 Oligo 6．71軟件設計1對引物，引 物 序 列 為：上 游 引 物 P1（BamH Ⅰ ）：5′－CGCGGATCCAGATCACACTACT－3′，下游引物 P2（XhoⅠ）：5′－，由大連 Takara公司合成。

1．4 PCR擴增 PCR反應體系：ddH2O 14．3μL，10×PCR buffer1．5μL，2．5mmol／LdNTP 2．0μL，上、下游引物各2．0 μL，模板DNA3．0μL，TaqDNA Polymeras 0．2μL，總體積25μL。PCR反應條件：95 ℃，5min；94 ℃，1min；52 ℃，1 min；72℃，1min；共30個循環；72℃延伸7min。PCR產物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．5 PCR產物的克隆和測序 用Solarbio凝膠回收試劑盒純化回收PCR產物與pMD18－T載體連接，連接產物轉化入E．coliDH5α感受態細胞，涂布于鋪有IPTG（0．1mol／L）和X－Gal（0．05mol／L）的LB的平板上，37℃培養過夜。進行藍白斑篩選，挑取生長良好的白色單個菌落進行增菌培養，用北京莊盟質粒小量抽提試劑盒提取重組質粒，進行BamH I、XhoI單、雙酶切鑒定和PCR鑒定，陽性重組質粒命名為pMD18－T－AceA。篩選陽性重組質粒送大連Takara公司測序。

1．6 結構和序列分析 用Lasergene7．0及ANTHEPROT本地軟件對糞腸球菌TLME3株AceA蛋白序列的組分、分子質量、滴定曲線與等電點進行預測；用Gene Runner軟件，對TLME3株AceA蛋白序列一級結構中糖基化位點、磷酸化位點和硫酸化位點等修飾位點和模序進行預測；用同源建模服務器SWISS－MODEL在線軟件，對TLME3株AceA蛋白的三級結構進行預測。用NCBI上BLASTn和BLASTp在線軟件對糞腸球菌TLME3株AceA基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列進行同源性搜索；用Lasergene7．0中MegAlign程序，將測定的TLME3株AceA基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列，與用BLAST在線軟件搜索得到的其他糞腸球菌AceA氨基酸序列進行多重比對，并用MEGA4．0軟件Phylogeny程序 Maximum Parsimony（MP）方法生成系統進化發育樹；根據序列比對結果計算TLME3株AceA氨基酸序列的變異率。

2 結 果

2．1 目的基因的擴增 以糞腸球菌TLME3株DNA為模板，用特異性引物進行PCR擴增，得到一個大小約957bp的條帶，與預期結果一致，見圖1。

圖1 糞腸球菌TLME3株AceA基因的PCR擴增M：DNA分子質量標準；S1：TLME3AceA PCR擴增產物；S2：ATCC29200AceA PCR擴增產物Fig．1 PCR amplification of AceA gene from E．faecalis strain TLME3M：DL2000DNA Marker；S1：Amplified Product of AceA from TLME3by PCR；S2：Amplified－Product of ATCC29200AceA by PCR

2．2 重組質粒的鑒定 將糞腸球菌TLME3株陽性重 組 質 粒 pMD18－T－AceA 進 行 PCR 鑒 定、BamH I單酶切鑒定和BamH I、XhoI雙酶切鑒定，結果見圖2。圖2中3 649bp的單酶切條帶是pMD18－T－AceA全長序列，2 692bp和957bp的雙酶切條帶分別是載體條帶和目的條帶，與預期結果一致，表明目的片段已經成功地與克隆載體連接。

陽性重組質粒測序結果TLME3株AceA基因核苷酸長957bp，用Lasergene7．0EditSeq程序查找的閱讀框為918bp，編碼306個氨基酸。將TLME3株AceA基因序列錄入GenBank中，登錄號為：JQ726492。

2．3 結構和序列分析

2．3．1 編碼蛋白理化特性及一級和三級結構預測用Lasergene7．0對TLME3株AceA蛋白組分、分子質量、滴定曲線和等電點進行預測。

AceA含有19種氨基酸，其中Thr最多，其次為Glu和Asn，疏水性氨基酸Ala、IIe、Leu、Pro、Val和Trp共82個，占總數的26．8%；分子質量為36．09kD；滴定曲線上等電點為4．32，表明AceA是酸性蛋白。

圖2 重組質粒pMD18－T－AceA單、雙酶切鑒定M：DNA分子質量標準；S1：重組質粒單酶切；S2：重組質粒雙酶切Fig．2 Identification of pMD18－T－AceA by double restriction enzymes digestionM：DL10，000DNA Marker；S1：The product from pMD18－T－AceA digested with BamH I；S2：The product from pMD18－T－AceA digested with BamH I and XhoI

用Gene Runner軟件預測的TLME3株AceA蛋白一級結構中，含有3個N糖基化位點、4個蛋白激酶C磷酸化位點、5個N肉豆蔻酰化位點和11個酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點。

用同源建模服務器SWISS－MODEL在線軟件預測的TLME3株AceA蛋白的三級結構，與搜索到的其他菌株AceA蛋白的3級結構同源性為98．63%，e值為5．94197e－68，可信度很大。

2．3．2 核苷酸及編碼氨基酸序列同源性和變異性分析 用BLASTn搜索出58個核苷酸同源序列，其中同源性為100%的序列1個、99%的序列20個、98%的序列34個、97%的序列3個；E值全部為0。用BLASTp搜索出84個氨基酸同源序列，其中同源性為100%的序列1個、99%的序列10個、98%的序列53個、97%的序列17個，96%的序列3個；E值也全部為0。細菌分離時間為1999年－2012年，來源為醫學臨床和人，分離地點為美國Houston和波蘭Warsaw。

用Lasergene7．0軟件 MegAlign程序Jotun Hein Method方法進行核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列比對，表1是根據序列比對結果列出的TLME3株AceA氨基酸及核苷酸變異情況。

表1 糞腸球菌TLME3株AceA基因核苷酸及編碼氨基酸的變異情況Tab．1 Variation situation of nucleotide and amino acid coded by AceA gene fromE．faecalis strain TLME3

用 MEGA 4．0MP方法構建的TLME3株AceA氨基酸序列系統發育進化樹如圖3。

3 討 論

本試驗中PCR擴增、pMD18－T－AceA重組質粒PCR鑒定、pMD18－T－AceA重組質粒單、雙酶切鑒定、AceA基因序列測定等結果顯示，成功克隆了糞腸球菌TLME3株AceA基因。通過核苷酸序列分析，證實插入序列與靶基因一致，閱讀框正確，長度為918bp，編碼306個氨基酸。為在原核細胞中表達糞腸球菌TLME3株AceA蛋白進而對其功能進行研究奠定了基礎。

BLAST是由NCBI推出的搜索核苷酸和氨基酸序列數據庫的最基本工具，它集速度、敏感性、彈性與統計處理的最佳結合于一身；在報告統計結果時除了顯示相似性以外，也描述相似片段出現的可能性－E值；是當前最受歡迎的搜索程序之一。本研究用BLASTn搜索出的同源序列與糞腸球菌TLME3株AceA基因核苷酸序列高達97%～100%的同源性和E值全部為0的結果表明，糞腸球菌AceA基因很保守，靶序列與同源序列肯定是同源基因。58個序列中，除了3個來源不明外，其余55個均來自于醫學臨床。目前還沒有在Gen－Bank注冊的動物源糞腸球菌AceA基因核苷酸序列。

圖3 TLME3株AceA氨基酸序列系統發育進化樹Fig．3 Phylogenetic tree based on the protein of AceA from the strain TLME3

在系統進化發育樹上，糞腸球菌TLME3株AceA與用BLASTp搜索到的84個蛋白質序列處于一個分支的2個節點上，表明它們來源于共同的祖先；與AAG23949處在同一位點上，同源性為100%；與ZP05569670、ZP07552605、ADN03976及AAG23952遺傳距離最近，在一個小分支上，同源性為99%；與其余79個序列遺傳距離也較近，同源性在96%～99%之間。

在本試驗克隆的糞腸球菌TLME3株AceA基因閱讀框核苷酸序列918個堿基中，有12個堿基變異，變異率為1．31%。其中只有6個核苷酸變異引起了編碼的5個氨基酸發生了變異〔113G→T（2）和114C→T（3）是編碼同一氨基酸的2個堿基〕，變異率為1．63%。在進化過程中，蛋白質序列較DNA序列更為保守，所以采用蛋白質序列進行同源性搜索更有意義。蛋白質序列搜索、系統進化發育樹構建和變異率計算結果都表明，糞腸球菌AceA基因很保守，具備保守性這個動物糞腸球菌性傳染病診斷及保護性抗原候選基因的關鍵條件。

糞腸球菌Ace是分泌在菌體外的表面蛋白，具有IgG樣折疊結構，可能具有免疫活性［7］。目前國內外的試驗證明了來源于人的糞腸球菌Ace蛋白對實驗動物（兔、小鼠）具有免疫活性［8－10］。由于糞腸球菌TLME3株能引起雛鵝敗血性疾病，造成高達30%～50%的病鵝死亡；致病性試驗中，小鼠各組死亡率總和為2．33，LD50為10－1．6229［11］。如果其AceA蛋白具有免疫活性，將其作為雛鵝糞腸球菌性敗血癥疫苗和診斷生物制劑的候選蛋白，有重要的研究價值。

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