李 鵬，宋楠楠，岳盈盈，李志會，張 穎，蓋中濤，孟 紅

腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）是引起嬰幼兒手足口病（Hand Foot and Mouth Disease，HFMD）的主要病原之一，其感染可導致部分患者無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經源性肺水腫、脊髓灰質炎樣癱瘓等神經系統并發癥，死亡率較高［1］。我國2008年安徽阜陽出現EV71手足口病暴發，近幾年各地的手足口病疫情不斷加劇［2］。目前重癥EV71手足口病的嗜神經性致病機制仍不明確，EV71毒力決定因子也未確定，給EV71的防治帶來很大困難。為探討序列變異對EV71流行和毒力變化的影響及目前濟南流行株的遺傳學背景，本研究對濟南市兩株分別源自輕癥和重癥手足口病人的EV71分離株進行全基因組序列的測定和比較分析，為EV71致病機制和嗜神經性毒力位點的研究提供參考。

1 材料與方法

1．1 毒株 EV71JN200803株，分離自2008年濟南市傳染病醫院僅患有皮疹的手足口病患者糞便標本，接種1日齡BALB／c小鼠無明顯臨床癥狀；EV71JN200804株，分離自2008年濟南市傳染病醫院患有無菌性腦膜炎手足口病患者的糞便標本，接種1日齡BALB／c小鼠可導致后肢麻痹，死亡。

1．2 試劑 RNA提取采用德國QIAGEN公司病毒RNA提取試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit），cDNA第一鏈合成試劑盒（QuantScript RT Kit）、高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase）及凝膠DNA回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit）均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1．3 引物 根據EV71安徽阜陽株（EU703812）并參考BrCr株全基因組序列，利用Primer5．0設計擴增EV71全基因組核苷酸序列引物，9對引物首尾相互重疊、覆蓋全基因組，見表1。

表1 PCR擴增用引物序列Tab．1 Primers used in PCR amplification

1．4 病毒總RNA的提取 把EV71JN200803、JN200804株經MA104細胞擴增得到的細胞培養物反復凍融3次，12 000g離心5min，取上清液140μL按RNA提取試劑盒的說明書進行操作。

1．5 RT－PCR 采用cDNA第一鏈合成試劑盒，將病毒總RNA逆轉錄成cDNA，取逆轉錄反應產物于25μL反應體系中進行PCR反應。PCR反應條件：94℃3min；94℃30s，N 30s，72℃1min，40 Cycles（N為退火溫度，各引物不同）；72℃10min。PCR擴增的特異性片段經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收后送公司測序、拼接。

1．6 全基因組序列的比對 采用clustalx1．83對EV71JN200803和JN200804的核苷酸和氨基酸序列進行比對，找出兩株病毒在核苷酸和氨基酸序列上的差異。

1．7 非編碼區的二級結構分析 采用RNAstructure5．3對EV71JN200803和JN200804株5′UTR和3′UTR的二級結構進行預測，并對其差異進行分析。

1．8 遺傳進化分析 采用 MEGA5．05軟件對EV71JN200803和JN200804株進行遺傳進化分析，將其與國內外各型EV71毒株的發育關系進行研究。

2 結 果

2．1 全基因組序列測定分析 不包含多聚腺苷酸尾EV71JN200803株全基因組長度為7 405nt，EV71JN200804株全基因組長度為7 404nt。JN200803株 5′端非編碼區（5′UTR）為 742nt，JN200804株為741nt；兩毒株基因組編碼區均為6582nt，編碼2193個氨基酸的多聚蛋白（Polyprotein）；3′端非編碼區（3′UTR）均為81nt。JN200803和JN200804株病毒基因組的組成和結構均符合EV71的特征。測定的全基因組序列已上傳至GENEBANK，EV71JN200803和JN200804株的序列登記號分別為：JF913464和HQ825317。

2．2 兩株EV71核苷酸和氨基酸序列差異分析EV71JN200803和JN200804株非編碼區核苷酸序列比較發現，5′UTR共有7個核苷酸的差異，除99位JN200804株缺失1個胞嘧啶核苷酸（C）外，其余6個均為核苷酸的轉換；3′UTR只有7347位1個核苷酸的發生轉換，見表2。EV71JN200803和JN200804株編碼區核苷酸及氨基酸序列比較發現，二者在編碼區沒有核苷酸的缺失和插入，共有98個核苷酸的差異，且突變類型全都屬于轉換，但大部分核苷酸的突變屬于同義突變，僅有16個造成了氨基酸的改變；16個突變氨基酸的分布為，VP3 3個，VP1 1個，2A1 個，2B3 個，2C4 個 ，3C2 個 ，3D2個，而VP4、VP2、3A和3B氨基酸沒有發生突變，表3。

表2 兩株EV71非編碼區序列比較結果Tab．2 Comparision of noncoding regions in JN200803 and JN200804

表3 兩株EV71編碼區序列比較結果Tab．3 Comparision of the coding regions in JN200803and JN200804

2．3 兩株EV71非編碼區二級結構差異分析EV71 5′UTR第453～561位堿基（BrCr株堿基位置）區與脊髓灰質炎病毒的內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）第Ⅵ結構域相對應，該區被認為同脊髓灰質炎病毒（poliovirus）的毒力密切相關［3］。然而EV71JN200803和JN200804株在此區核苷酸序列完全相同，表明造成二者毒力差別的毒力決定位點可能并不在5′UTR。采用RNAStructure5．3對3′UTR進行了RNA二級結構預測。從圖1可以看到EV71JN200803和JN200804株二級結構僅3′UTR第23位（基因組7347位）與第52位（基因組7376位）堿基配對有差異，JN200803的 G－T不能形成穩定的配對，而JN200804的A－T的配對很穩定。JN200804株形成二級結構所需自由能低于JN200803株，毒力較強的JN200804株的二級結構更穩定。

圖1 JN200803和JN200804株3′UTR二級結構預測Fig．1 Computer－predicted secondary structures of EV71 3′UTR of JN200803and JN200804Note：ΔG of JN200803and JN200804were﹣25．4 kcal／mol and﹣25．8kcal／mol，respectively

2．4 兩株EV71的遺傳進化分析 采用MEGA5．05軟件，通過鄰接法（Neighbor－joining），以柯薩奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CVA16）為外群，對EV71JN200803、JN200804及GenBank中各亞型EV71的VP1及全基因組核苷酸序列進行遺傳進化分析（圖2，圖3）。可見JN200803和JN200804株與Fuyang／17．08／1株進化關系最近，同屬于C4基因亞型的C4a進化分支。2008年國內主要的EV71流行株進化關系非常密切，與國外EV71毒株進化關系較遠。

3 討 論

圖2 EV71VP1區的遺傳進化分析Fig．2 Phylogenetic tree of VPl regions in EV71

圖3 EV71全基因組核苷酸序列的遺傳進化分析Fig．3 Phylogenetic tree of complete genomic nucleotide sequences in EV71

EV71進化過程中的基因突變是造成毒力改變的主要因素之一。McMinn等［4］發現EV71澳大利亞流行株中只表現HFMD與具有神經毒性分離株的主要區別在于VP1第170氨基酸從丙氨酸（Ala）突變 為 纈 氨 酸 （Val）。Fujimoto 等［5］發 現 日 本Hyogo地區表現為腦干腦炎EV71毒株的VP4基因序列均一致，與表現為手足口病EV71毒株有較大差異。Shih等［6］比較了致死和非致死病例感染的EV71的基因組全序列，發現非結構蛋白3C區域的核苷酸序列存在較大差異。Chang等［7］對中國6株不同毒力EV71分離株全基因組序列分析發現，3株臨床輕癥分離株與3株臨床重癥分離株唯一相同的差別是第1994位氨基酸（3D區）由纈氨酸（Val）突變為異亮氨酸（Ile）。Wang等［8］將實驗鼠感染不致病EV71毒株4643與具有神經嗜性突變毒株MP4進行全基因組序列分析，結果MP4 5′UTR區有4個核苷酸突變。

本文兩株不同毒力EV71的全基因組序列比較發現，編碼區有16個氨基酸發生了突變，其中VP3 3個，VP1 1個，2A1個，2B3個，2C4個，3C2個，3D2個，而VP4、VP2、3A和3B氨基酸未發生突變。其中3D區的突變與中國其他省EV71輕重株（重株：安徽1株、河南2株，輕株：重慶3株）氨基酸突變不同［7］，JN200803和JN200804株第1994位氨基酸均為異亮氨酸（Ile），與重慶的3株輕株相同。VP3、2A、2B和2C區雖然在已有報道中不是常見的毒力決定區域，但也可能存在對病毒毒力有影響的位點，Whitton等［9］發現脊髓灰質炎病毒VP3第91位氨基酸對病毒致病性具有重要意義。因而EV71毒力決定位點不但具有非單一性，而且具有明顯的區域獨特性，與當地的流行特點密切相關。

小 RNA 病毒科 （picornaviridae）病 毒 的5′UTR有一個與翻譯密切相關的IRES，EV71與脊髓灰質炎病毒的IRES為同一類型，結構與功能極為相似［10］。脊髓灰質炎病毒IRES的第Ⅵ結構域被認為與其毒力密切相關，而JN200803和JN200804株在此區域核苷酸序列完全相同，可見EV71濟南分離株的毒力決定位點可能不在5′UTR。EV71 3′UTR被認為與病毒負鏈合成相關，對病毒基因組的轉錄和復制有重要的調控作用，而EV71 JN200803和JN200804株3′UTR只有一個核苷酸的不同，分析發現JN200804株的二級結構更穩定，對病毒基因組的轉錄和復制更為有利。

通常認為VPl區全長核苷酸序列分析可作為腸道病毒屬血清型分類的依據［11］。本文將EV71濟南分離株與2008年國內主要流行株及其他亞型EV71進行了VP1和全基因組遺傳進化分析，發現兩株EV71濟南分離株同屬C4亞型的C4a進化分支，與Fuyang／17．08／1株進化關系最近，應具有共同的起源。另外，中國大陸1998年以來的EV71毒株均為C4亞型，2008年的分離株均為C4亞型的C4a進化分支；與國外病毒株相比，中國大陸EV71分離株與中國臺灣分離株的親緣關系更近。總之，對相同疫源中不同毒力EV71分離株（EV71 JN200803和JN200804株）的全基因組序列進行比較，發現潛在的毒力決定位點，分析EV71的變異情況和流行特點，對EV71手足口病的防治具有重要意義。

［1］Schuffenecker I，Mirand A，Antona D，et al．Epidemiology of human enterovirus 71infections in France，2000－2009［J］．J Clin Virol，2011，50（1）：50－56．

［2］陳煒，周朝暉，沈曉娜，等．福建省腸道病毒71型分離株（2010FJLY008）全基因組核苷酸序列分析［J］．中國人獸共患病學報．2011，27（1）：14－18．

［3］Klinck R，Sprules T，Gehring K，et al．Structural characterization of three RNA hexanucleotide loops from the internal ribosome entry site of polioviruses［J］．Nucleic Acids Res，1997，25（11）：2129－2137．

［4］McMinn P，Lindsay K，Perera D，et al．Phylogenetic analysis of enterovirus 71strains isolated during linked epidemics in Malaysia，Singapore，and Western Australia［J］．J Virol，2001，75（16）：7732－7738．

［5］Fujimoto T，Chikahira M，Yoshida S，et al．Outbreak of central nervous system disease associated with hand，foot，and mouth disease in Japan during the summer of 2000：detection and molecular epidemiology of enterovirus 71［J］．Microbiol Immunol，2002，46（9）：621－627．

［6］Shih SR，Ho MS，Lin KH，et al．Genetic analysis of enterovirus 71isolated from fatal and non－fatal cases of hand，foot and mouth disease during anepidemic in Taiwan，1998［J］．Virus Res，2000，68：127－136．

［7］Chang GH，Lin L，Luo YJ，et al．Sequence analysis of six enterovirus 71strains with different virulences in humans［J］．Virus Res，2010，151（1）：66－73．

［8］Wang YF，Chou CT，Lei HY，et al．A Mouse－Adapted Enterovirus 71Strain Causes Neurological Disease in Mice after Oral Infection［J］．J Virol，2004，78：7916－7924．

［9］Whitton JL，Cornell CT，Feuer R，et al．Host and virus determinants of picornavirus pathogenesis and tropism［J］．Nat Rev Microbiol，2005，3（10）：765－776．

［10］Tsai FJ，Lin CW，Lai CC，et al．Kaempferol inhibits enterovirus 71replication and internal ribosome entry site（IRES）activity through FUBP and HNRP proteins［J］．Food Chemistry，2011，128（2）：312－322．

［11］Zhang Y，Tan XJ，Wang HY，et al．An outbreak of hand，foot，and mouth disease associated with subgenotype C4of human enterovirus 71in Shandong，China［J］．J Clin Virol，2009，44（4）：262－267．