廣西甜茶質量控制方法的研究進展

吳柳春

廣西柳州食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545006

廣西甜茶質量控制方法的研究進展

吳柳春

廣西柳州食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545006

本文介紹了1980年～2012年來廣西甜茶質量控制方法的研究進展，按照定性、檢查、定量測定指標性成分的質量控制模式將文獻分類進行綜述。

廣西甜茶;化學成分;含量測定;綜述

廣西甜茶是廣西特有的藥食同源的野生珍稀甜味植物，與羅漢果、甜葉菊并稱廣西三大甜味植物。為薔薇科植物甜葉懸鉤子 Rubus Suavissimus S.Lee.的干燥葉［1］，主要分布于柳州、桂林、梧州等地區。性味甘、平、無毒，具有無糖自然甜的神奇效果，在廣西民間以葉當茶飲用歷史悠久，民間又稱之為“神茶”;入藥有清熱、潤肺、祛痰、止咳的功效，用于咳嗽痰多，或作甜味劑［2］。

廣西甜茶的主要化學成分有:甜茶甙 (Rubusoside)又稱甜茶素，是廣西甜茶的主要甜味成分及活性成分。為斯特維 (Steviol)和葡萄糖結合而成的四環二萜甙［3－5］，甜茶苷的甜度約為蔗糖甜度的300倍［6］，是低熱值、甜度高、食用極為安全的天然甜味劑;黃酮類化合物是甜茶中的重要化學成分，其甙元為槲皮素和山奈酚［7］，具有抗氧化、預防心血管疾病等作用;多酚類物質一直都是甜茶中的重要活性成分，富含特有的GOD型鞣花單寧，是治療對花粉癥等鼻炎過敏反應的活性物質［8］。甜茶葉中含有7個多酚型化合物［9］，其抗過敏有效成分為水解型鞣花鞣質［10］;甜茶葉營養成分豐富，含有蛋白質、氨基酸、維生素、微量元素、粗纖維等［6］?，F將廣西甜茶質量控制方面三十多年來的研究進展作如下綜述。

1 定性鑒別

1.1 植物形態與性狀鑒定 早在1981年，廣西植物研究所的李樹剛教授［1］就對甜茶原植物進行詳細描述和鑒定。廣西甜茶為薔薇科懸鉤子屬的一個新種 (Rubus Summissimus S.Lee.)，多年生有刺落葉灌木，高1～3米，莖直立或傾斜，常被白粉，幼苗時紫紅色;單葉互生，幼苗時初生葉5深裂 (絕不為3深裂)，葉紙質，近圓形，先端漸尖，邊緣具重鋸齒，葉甚甜;花單生葉腋，白色，直徑2～3cm，垂生，單花瓣5片;聚合果卵球形，幼時灰青色，熟時橙紅色，味甜可食。

甜茶葉干品［2］多皺縮，黃綠色或淺黃棕色。完整葉展平后輪廓近圓形，長5.2～11cm，寬5～13cm，基部近心形或狹心形，掌狀5～7深裂，裂片披針形或橢圓形，中央裂片較長，先端漸尖，邊緣具重鋸齒，基出脈通常7或5條，兩面稍突起。葉柄長2～5cm，上面有淺槽，下面具小刺1～2枚。氣微，味甜。

韋家福和黃燮才1996年也發表文章［11］對廣西各地俗稱甜茶的原植物進行鑒定甄別。陸健、李遠志［12］等對甜茶的植物學形態特性提出真假甜茶的鑒別方法。

銀勝高、劉君玲［13］等人對甜茶的植物形態與性狀進行定性鑒別研究。

1.2 顯微鑒別 銀勝高、杜蘭哲［14］等人采用石蠟切片技術對廣西甜茶的根、莖、葉進行處理后，運用顯微攝影技術進行顯微鑒別研究，其實驗結果如下。

1.2.1 根橫切面 呈類圓形，由木栓層、次生維管束組成。木栓層稍厚，由十多列扁平類長方形細胞組成;皮層較窄，細胞排列疏松，偶見草酸鈣簇晶;維管束外韌型，韌皮部較寬，有纖維束散在，在髓射線上的薄壁細胞可見大量草酸鈣簇晶;形成層明顯;木質部約占整個切面直徑的2/3，細胞木化，導管類圓形常以單個或2～3個相聚的形式均勻呈放射狀排列;射線明顯，排列較整齊。

1.2.2 莖橫切面 呈類圓形，莖由表皮、皮層、維管束和髓等組成。表皮細胞1列，類方形或類圓形，排列整齊，外被角質層;皮層細胞排列緊密，薄壁細胞含有草酸鈣簇晶單個散在;內皮層明顯，類方形或類長方形，排列整齊;維管束外韌型，斷續成環;韌皮部較窄，有帽狀的纖維束，形成層明顯，維管束斷續成環;髓部寬廣，約占4/5，細胞較大，排列疏松。

1.2.3 葉橫切面葉 由表皮、葉肉和維管束組成。上表皮細胞1列，長方形或方形;下表皮細胞1列，類方形或類圓形，較小，可見氣孔;上下表皮外被角質層，呈細齒狀;葉肉由柵欄組織和海綿組織組成;柵欄組織2列細胞，不通過主脈;海綿組織疏松，細胞內偶見簇晶;主脈維管束1個;木質部位于向莖面，導管類圓形常以單個或2～3個相聚的形式縱向排列;形成層明顯;韌皮部位于背莖面，有大量草酸鈣簇晶;主脈出上下表皮內側均具厚角組織;薄壁細胞中可見大量簇晶。

粉末［13］黃綠色或淺黃棕色。非腺毛由單細胞組成，表面光滑細長，直徑14～20μm;螺紋導管多見，直徑10～25μm;纖維較少，直徑11～17μm;草酸鈣簇晶多見，直徑5～18μm。

1.3 理化鑒別

1.3.1 酒石酸鐵法試驗［12］取甜茶3克，加入150ml沸水沖泡5min，濾過。取濾液 0.5ml，加 10ml水顯色劑 (取0.1gFeSO4·7H2O和0.5g酒石酸鉀鈉配成100ml水溶液為顯色劑)，混合后溶液呈藍褐色 (檢測多酚類成分)。

1.3.2 三氯化鋁法試驗［12］取甜茶3g，加入150ml沸水沖泡5min后濾過。取濾液0.5ml，加10ml顯色劑 (取1.8 g A LCI 3.6 H2O，定容100ml水溶液為顯色劑)，混合后溶液呈淺橙黃色 (檢測黃酮類成分)。

1.3.3 堿液試驗［13］取甜茶水提溶液點于濾紙片上，(干后，再點一次，使其溶液集中)，干后，在氨蒸氣中熏約5 min，呈現橙黃色。將氨氣熏過的濾紙露置空氣中，顏色逐漸褪去而變為原有的暗黑色。(檢測黃酮類或苷類成分)

1.3.4 α－萘酚試驗［13］取甜茶水提溶液1 ml置試管中，加5%α－萘酚試液數滴振搖后，沿管壁滴入5～6滴濃硫酸，液體分層，待2～3 min后，兩層液面間出現紫紅色環。(檢測甜茶苷類成分)。

1.3.5 泡沫試驗［13］取甜茶水提溶液2ml置帶塞試管中，用力振搖約3min，產生持久性蜂窩狀泡沫 (可持續10min以上)，且泡沫量約為液體體積的1/3(檢測皂苷類成分)。

1.4 薄層色譜鑒別

1.4.1 取甜茶［12］10g用50ml乙醇浸提，提取液點于硅膠薄板或濾紙上，晾干，噴灑5%磷酸鋁乙醇溶液，噴后置于120℃ 烘箱中烘烤15min，呈藍色斑點 (檢測甜茶苷類成分)。

1.4.2 取甜茶［13］1g，加水30ml超聲60min，過濾，濾液作為供試品溶液。另取甜茶素適量，用水溶液配成每1ml含1.0mg的溶液，作為對照品溶液。參照薄層色譜法 (中國藥典2005年一部附錄UIB)試驗，分別吸取對照品溶液和供試品溶液各10～15μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿－甲醇－水 (5∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干放入碘缸中顯色，5min后檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同黃色斑點，Rf值為0.73(檢測甜茶苷類成分)。

1.5 紅外光譜鑒別 傅里葉變換紅外光譜方法具有準確、簡便、快速和經濟的特點，已廣泛應用于中藥及中藥材真偽鑒別。唐輝、孔德鑫［15］等人運用傅里葉變換紅外光譜法，采集7份不同產地甜茶葉片的FTIR圖譜，結合相關性系數和二階導數方法對其紅外光譜特征進行指認，并比較各供試甜茶的紅外指紋圖譜及甜茶苷含量間差異。研究結果表明，運用FTIR技術可以對不同產地甜茶進行快速鑒別。

1.6 高效液相色譜鑒別 張巧云［16］利用RP－HPLC法，根據HPLC的保留時間定性和加入法定性原理，鑒別甜茶葉中甜茶素、黃酮甙元 (槲皮素與山奈酚)。甜茶素色譜條件為:色譜柱:Turner YWG C18(5μm，4.6mm×250mm);流動相:V(甲醇) ∶V(水) =70∶30;流速:1.0mL/min;檢測波長:210nm;靈敏度:0.005;柱溫:室溫。黃酮甙元 (槲皮素與山奈酚)色譜條件為:色譜柱:Turner YWG C18(5μm，4.6mm ×250mm);流動相:V(甲醇):V(水):V(磷酸) =60:40:0.3流速:1.0mL/min;檢測波長:360nm;靈敏度:0.005;柱溫:室溫。

2 檢查

陸健、李遠志［12］等率先報道用茂福爐法測定灰分、用全量法測定水浸出物來控制廣西甜茶質量。

銀勝高、劉君玲［13］等人參照中國藥典2005年版一部附錄，分別對廣西瑤山甜茶樣品中的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物 (冷浸和熱浸)進行測定，較全面的開展了甜茶常規檢查項目研究。

3 含量測定

3.1 甜茶苷 吳祖祥、孟麗珊［17］等人采用薄層層離－分光光度法測定甜茶中甜茶素的含量。其方法首先把苷加酸水解為異苷元 (isosteviol)，再將異苷元和2，4一二硝基苯肼作用制成腙，經薄層分離后將色帶洗脫，在362nm處測定吸收值。該方法流程較長，操作繁瑣，全程加樣回收率為96.85±1.89%。

盧昕等［18］首次采用反相高效液相色譜法測定了廣西甜茶中的甜茶素。條件為:反相C18柱;甲醇－水 (體積比85:15)溶液為流動相，流速1.0 mL/min;檢測波長210 nm;柱溫20℃;外標法定量。結果表明:甜茶素的質量濃度為20～1200mg/L時，其峰面積與質量濃度具有良好的線性關系，相關系數為0.998。方法的檢測限 (S/N≥3)為5 mg/L，峰面積測定值的相標準偏差 (RSD)為0.85%(n=8)。甜茶素工業品及甜茶原葉中甜茶素的平均回收率 (n=3)分別為100.2%和104.9%。該方法快速簡便，準確可靠，可用于甜茶產品質量的例行監測。

張健、葉麗瓊［19］采用高效液相色譜法測定廣西甜茶中的主要甜味成分甜茶苷，色譜條件:C18柱;甲醇－三氟乙酸溶液 (體積比為75∶25)為流動相;流速1.0mL/min;檢測波長208 nm;柱溫30℃;外標法定量。結果表明:線性范圍為300mg/L～2000mg/L，相關系數r為0.999 1，平均回收率 (n=3)為103.9%。該方法對不同生長時期甜茶葉中的甜茶苷含量進行測定，考查了其中的變化規律。

銀勝高、劉君玲［13］等人以甜茶素為指標，采用高效液相色譜法測定廣西甜茶含量。色譜條件:色譜柱為Water Symmetry C18柱 (150mm×4.6mm，5μm);流動相為乙腈－水 (32∶68);進樣量10μL;流速1mL/min;檢測波長205nm;柱溫35℃;外標法定量。結果表明:線性范圍為1.038～10.38μg，相關系數r為0.9999。平均回收率 (n=6)為98.31%，RSD為1.62%。該實驗方法可行，重復性好，能有效控制廣西甜茶藥材的質量。

超高效液相色譜－質譜法 (UPLC－MS)是21世紀初發展起來的一種分析技術，它是結合了UPLC的高效分離能力與MS的高靈敏度和極強的專屬性的分離檢測技術。張健、俞桂新［20］等人首次采用超高效液相色譜－質譜聯用法測定廣西甜茶葉中甜茶苷的含量。樣品經前處理后以Acquity UPLCBEH C18柱為色譜柱，流動相為乙腈 (含體積分數為0.1%甲酸) －蒸餾水 (含體積分數0.1%甲酸)，梯度條件為10 min乙腈相體積由20%變化到65%，柱溫35℃，進樣量5 μL，流速0.15mL/min。在質譜儀上以電噴霧電離正離子模式多離子反應監測 (MRM)方式進行定量分析，監測的離子為 m/Z 643→319。甜茶苷的線性范圍0.1—10.0 μg/mL，r=0.9996，加標回收率為96.6%，檢出限0.04μg/mL;定量下限為0.1μg/mL。該法操作簡便、靈敏度高、重復性好，可快速測定甜茶葉中甜茶苷含量。

樊蘭蘭、韋瑋［21］等人采用超快速液相色譜法 (RSLC－DAD)，建立了廣西甜茶制劑中甜茶素含量的測定方法。色譜條件:色譜柱為Dionex RSLC 120 C18柱 (50mm×2.1mm，2.2μm)，流動相為乙腈－水 (36∶64)，檢測波長205nm，柱溫40℃，流速0.3mL/min，進樣量2μLl。結果:甜茶素的線性范圍為0.03～0.6μg;加樣回收率為99.1%，RSD為0.97%(n=9);21份在中國和日本市售甜茶制劑中甜茶素的含量范圍為0～63.79mg/g。該檢測方法簡便、快速、可靠，可顯著縮短分析時間和節省有機溶劑，為建立科學合理的廣西甜茶制劑質量標準提供依據。

3.2 黃酮類 陸健、李遠志［12］等用硼酸一檸檬酸比色法測定廣西甜茶中的黃酮含量。

陳全斌、譚冬明［22］等利用高效液相色譜法，測定廣西甜茶不同部位總黃酮含量，色譜條件:Hypersil C18(5μm，4.6mm×250mm)為色譜柱;V甲醇∶V水∶V磷酸 (60∶40∶0.3)為流動相;流速:1.0mL/min;檢測波長:360nm;靈敏度:005;柱溫:室溫。試驗結果表明:甜茶各部位總黃酮含量由高到低的排列順序是:嫩葉、中莖皮、老莖皮、果實、嫩莖皮、老葉、中莖、老莖;根部和嫩莖的黃酮含量為零。嫩葉的含量最高，但老葉的含量卻較低。為了解和掌握廣西甜茶植株黃酮類化學成分分布提供理論依據。

吳柳春和黃桂華［23］建立廣西甜茶中黃酮苷元槲皮素和山奈酚的HPLC定量分析方法。色譜條件:以Shim－pack VP－ODS(4.6mm×250mm，5μm)為色譜柱，甲醇－0.4﹪磷酸 (52∶48)為流動相，流速 1.0 mL·min－1，檢測波長370nm，柱溫40℃。結果:槲皮素和山奈酚的線性范圍分別為0.2310～1.2780μg及0.1918～1.1511μg;平均回收率分別為100.3﹪ (RSD=1.6﹪)和97.8﹪ (RSD=1.2﹪)。所建立的方法準確、可靠，重現性好，可用于廣西甜茶中黃酮成分的定量分析，能有效控制廣西甜茶的內在質量。

3.3 多酚類 陸健、李遠志［12］等利用鞣質有較多酚羥基易被氧化的性質，用高錳酸鉀滴定法測定廣西甜茶中的多酚類含量。

莫建光、陳秋虹［24］等建立高效液相色譜法測定廣西甜茶中水解型鞣花鞣質含量的方法。色譜條件:WatersC18柱(250.0mm×4.6mm，5μm)，柱溫40℃，用乙腈－0.2%磷酸(體積比18∶82)為流動相，檢測波長為254nm，外標法定量。結果:鞣花酸在0.1000～0.8755mg/ml內與峰面積呈良好的線性關系，r=0.9991，最低檢出限為0.65μg/ml，平均加標回收率為97.12%，RSD為1.04%。該方法精確可靠，可作為廣西甜茶中水解型鞣花鞣質含量測定的方法。

3.4 氨基酸和微量元素 陸健、李遠志［12］等用茚三酮顯色分光光度法測定游離氨基酸;用日立825型氨基酸自動分析儀測定水解氨基酸。

溫桂清、陳全斌［25］等采用火焰原子吸收光譜法(FAAS)測定廣西甜茶根、莖和葉中的微量元素 (Ca、K、Na、Mg、Cu、Fe、Zn和 Mn)的含量。儀器工作條件:WFX－1F2型原子吸收分光光度計;Ca、K、Na、Mg、Cu、Fe、Zn和Mn共8種元素空心陰極燈。結果:標準曲線的相關系數為0.995 5～0.999 6，相對標準偏差為0.53% ～2.02%，加標回收率為97.7%～103.3%;甜茶根、莖和葉的金屬元素含量次序為:K ＞Mg＞Ca＞Fe＞Na＞Zn(Mn) ＞Cu，甜茶葉的Ca、K、Na、Mg和Mn含量明顯大于根和莖?；鹧嬖游展舛确y定廣西甜茶中微量元素，具有很好的精密度和準確度。

溫桂清、陳全斌［26］等再次采用FAAS法測定甜茶不同部位的重金屬鉛和鎘。即將甜茶樣品的根、莖和葉經烘干、灰化及灼燒，用濃硝酸溶解殘渣，利用火焰原子吸收光譜 (FAAS)法對溶解液中的重金屬元素鉛和鎘進行了測定。Pb和Cd標準曲線的相關系數分別為0.999 0和0.993 8，相對標準偏差為0.26%～1.38%，加標回收率為99.3%～101.2%。結果表明所測甜茶的根、莖和葉中Pb的含量均超過國家標準。

3.5 其它成分 陸健、李遠志［12］等采用蒽酮顯色分光光度法測定廣西甜茶中的總水溶性碳水化合物含量及采用分光光度法測定葉綠素含量。

鄒青松、陳山［27］等為探明瑤山甜茶中可溶性糖的含量和種類，采用蒽酮－硫酸比色法測定其可溶性總糖含量;運用高效凝膠過濾色譜法 (HPGFC)測定多糖分子量分布范圍，并利用高效液相色譜－蒸發光散射檢測器 (HPGFC－ELSD)法在兩種流動相體系中測定和分析其低分子寡糖和單糖的種類與含量。結果表明:瑤山甜茶中可溶性總糖含量為15.20%，相對標準偏差 (RSD)為0.996%;多糖分子量Mw范圍為51551～55628，RSD為0.64% ～1.23%;單糖種類主要為木糖、果糖和葡萄糖，相對含量分別是0.54%、52.18%和42.76%。實驗表明，本文所建立的實驗方法重現性較好，操作性強，可用于瑤山甜茶的糖類分析，為瑤山甜茶這一優良的食藥兩用資源的產品深開發提供實驗數據和依據。

4 結語

廣西甜茶具有“茶、糖、藥”三種功效，是一種極具開發價值的糖類替代品和保健品。目前廣西甜茶現行的質量標準較為簡單［2］，僅有性狀鑒別項目。從上述文獻可知，目前國內專家學者對廣西甜茶質量控制方法的研究文獻報道較全面，研究方法與檢測技術與時俱進。特別是近年來，在定性定量項目方面運用了許多新技術、新方法，包括顯微攝影技術、紅外指紋圖譜鑒別、高效液相色譜法、超高效液相色譜－質譜聯用法、原子吸收光譜法等，它們具有高靈敏度、高準確度、專屬性強的共同特點，將會成為甜茶質量控制分析方法的重要手段。如何制定科學合理的廣西甜茶質量標準，全面監控甜茶的內在質量，保證甜茶的有效性和安全性，提高市場競爭力，是擺在我們面前的一項急迫的任務。

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R284.1

A

1007－8517(2012)15－0053－03

吳柳春 (1963－)，女，漢族，湖北黃陂人，大專，主管藥師，主要從事中藥質量分析和質量管理工作。E－mail:liuchunwu63@yahoo.com.cn。

2012.05.29)