超聲靶向微泡破裂在分子生物學中的應用

金佳美（綜述） 陳 明（審校）

超聲靶向微泡破裂在分子生物學中的應用

金佳美（綜述） 陳 明（審校）

超聲靶向微泡破裂；基因療法；分子生物學

【中國圖書資料分類法分類號 】R445.1

超聲微泡自1968年由Gramiak及Shah報道發現至今，已廣泛應用于提高超聲診斷的分辨力、敏感性和特異性。然而超聲微泡的作用并不僅僅局限于臨床超聲診斷，近年來，超聲靶向微泡破裂（ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD）技術在分子生物學領域迅速發展，利用微泡在超聲介導下的空化效應可以達到靶向給藥、靶向治療的作用。Lawrie等[1]發現使用超聲聯合微泡造影劑對血管內皮細胞進行質粒DNA轉染，轉染效率較裸露DNA增加了近3000倍。自此，UTMD在基因治療中的重要作用逐漸得到認識和發展。本文就UTMD在分子生物學中的應用最新動態作一綜述。

1 UTMD的轉染原理

超聲波本身具有促進基因轉染的作用[1]，聯合使用超聲造影劑微泡可進一步提高轉染效率，其原理主要是目的基因通過表面黏附或內部包裹的方式與微泡結合，然后通過超聲介導在靶細胞或組織中，由微泡靶向傳輸基因或藥物[2]，超聲波的空化效應可以導致組織細胞膜通透性增高，而微泡又能降低超聲波的空化閾值，從而增強空化效應，使局部毛細血管破裂，鄰近組織細胞間隙增寬，從而使目的基因更容易進入組織細胞內而提高局部組織及細胞的基因轉染和表達，達到基因治療疾病的目的[3,4]。Hallow等[5]證明空化效應釋放出強大的聲能，引發多種生物學效應，形成聲孔。細胞膜出現暫時且可逆的小孔，使細胞外大分子能夠得以進入細胞的現象稱為聲孔效應，聲孔效應可能是基因成功轉染的基礎。雖然空化效應和機械效應使細胞膜通透性增加是增強基因轉染的主要原理，但UTMD促進基因轉染效率的確切機制尚不明確。Bekeredjian等[6]認為目的基因的轉染也與超聲、質粒及微泡的結合方式有關，由此可以認為細胞膜通透性增加不是UTMD增加轉染效率的唯一機制，而是多因素影響的過程，其詳細機制仍在進一步研究中。

2 UTMD在藥物傳輸中的應用

超聲造影劑微泡可以通過不同方式攜帶藥物，通過特殊的聲孔效應經靜脈途徑靶向給藥，超聲輻照介導微泡造影劑定向釋放藥物，這種效應可以改變藥物的分布，增加藥物局部濃度，減少不良反應。康娟等[7]發現多西紫杉醇脂質微泡聯合UTMD能抑制兔VX2肝癌的微血管生成，從而抑制兔VX2肝癌的生長。

溶栓治療已經成為超聲微泡藥物運輸系統的應用方向，在理想條件下，超聲聯合微泡可以完全溶解血栓[8]。Flores等[9]發現將溶栓劑組織型纖溶酶原激活物和超聲微泡聯合應用不僅能有效溶栓，還能顯著降低急性腦卒中患者的顱內出血。

UTMD對于腫瘤、炎癥、血栓等都有顯著的治療效果，對多種組織器官的療效也在不同動物模型中得以證實，相信在進一步完善各項參數條件后，UTMD能夠真正運用到臨床治療中。

3 UTMD在基因轉染中的應用

自2000年首次報道UTMD用于體外基因轉染以來，該技術在體內外實驗中均取得較顯著的效果，用于轉染各個系統臟器。作為一種非病毒轉染方法，UTMD較傳統的脂質體、陽離子聚合物等方法顯示出其獨特的優勢。

3.1 UTMD在腫瘤基因治療中的應用 目前常用的UTMD腫瘤基因治療方法主要有以下幾種：①自殺基因療法，又稱為基因介導的酶前藥物治療。Li等[10]發現超聲介導下自殺基因KDRP-CD/TK對乳腺癌MCF-7細胞有顯著的抑制作用。Zhou等[11]將單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）自殺基因微泡通過UTMD技術作用于小鼠肝癌模型，效果明顯。②抗腫瘤新生血管形成療法。Kou等[12]通過RNA干擾（RNAi）技術阻斷血管內皮生長因子受體后，腫瘤血管生成減慢。而通過UTMD技術完全可以靶向干預血管內皮生長因子受體，得到相同甚至更佳效果。③基因替代療法。Luo等[13]利用UTMD將野生p53基因轉染視網膜母細胞瘤Y79細胞，不僅較傳統轉染方法效率更高，抑制作用也顯而易見。④反義基因療法。載反義mRNA微泡經超聲介導轉染神經膠質瘤細胞，經檢測腫瘤特異蛋白表達水平顯著降低，充分說明其抑制作用?？梢姡琔TMD在腫瘤基因治療中具有良好的應用前景。

3.2 UTMD在組織器官基因治療中的應用 除腫瘤外，在心血管[14]、肺[15]、腦[16]、脊髓[17]、子宮[18,19]、胰腺[20]、腎臟[21]、視網膜[22]、皮膚[23]、睪丸[24]等的轉染實驗中，UTMD均表現出安全和高轉染效率的優點。UTMD 可高效、靶向轉染目的基因而無明顯組織損傷，是一種安全、簡單、有應用前景的非病毒基因傳輸方法。

4 UTMD的影響因素

UTMD對不同器官組織作用程度的不同會造成藥物傳輸及基因轉染效率的不同，主要受到3個方面的影響：一是介導超聲的參數；二是所使用微泡的特性；三是微泡輸入的途徑及超聲微泡作用局部的環境。

與超聲相關的參數變量有聲強、持續時間、頻率、束流截面、衰減作用等。對超聲參數的優化主要體現在參數設定方面，即能夠產生足夠的聲能形成盡可能多的外溢孔，使得所傳輸的藥物及基因能夠進入細胞及組織間隙中，提高藥物作用效能及基因轉染效率，但這應基于在細胞組織耐受并不會產生明顯不良反應的基礎上。因此，對超聲參數的優化對于成功地應用UTMD介導藥物傳輸或基因轉染都是至關重要的。在組織能耐受的情況下高聲強和低頻率超聲照射對細胞轉染是最為有效的[25]，且超聲輻照的時間不宜過長，否則微泡會因為長時間的超聲輻照而被大量清除，使轉染效率降低[26]。Zarnitsyn等[27]采用pEGFP-N1及pGL3對DU145前列腺癌細胞進行轉染，以優化轉染過程中聲強、微泡濃度、細胞密度、質粒濃度、溫度、輻照時間等轉染條件，實驗結果顯示，優化后的超聲參數能夠在保證細胞耐受及DNA質粒完好的條件下提高轉染效率。

微泡的性質也是UTMD介導藥物傳輸及基因轉染的重要因素，只有適合的微泡才能完成運輸轉染。微泡相關變量有微泡外殼成分構成、微泡中氣體的性質、劑量、濃度、輸注時間等，當超聲微泡結合脂質體或陽離子聚合物時，也會明顯增加轉染效率[19]。除自制的微泡外，獲批上市的微泡造影劑有 SonoVue、Levovist、Optison、De fi nity、Sonazoid及biSphere等。Wang等[28]用攜帶綠色熒光的DNA質粒分別與SonoVue、Optison和Levovist混合，結果顯示，Optison在沒有超聲介導的條件下即能夠提高轉染效率。在超聲輻照的條件下，Optison也能夠提高基因轉染效率，但是與僅使用Optison造影劑條件下的轉染率無明顯差異。而SonoVue在聯合超聲輻照后，轉染效率較單獨使用時明顯增加。只有Levovist無論是否結合超聲輻照對轉染效率均無明顯益處，在沒有超聲輻照的條件下反而會降低轉染效率，而且較SonoVue及Optison的安全性低。Optison及SonoVue能提高轉染效率在很大程度上與其自身化學組成有關，Optison微泡的白蛋白外殼及八氟丙烷氣體、SonoVue微泡的磷脂外殼及六氟化硫氣體不同于Levovist微泡的半乳糖外殼及空氣，帶正電荷的白蛋白及陽離子脂質體均有助于基因轉染，而且全氟化碳氣體溶解度比空氣低，保證其穩定性更佳，同樣擁有脂質體外殼及全氟化碳氣體的De fi nity微泡對基因轉染也起促進作用，證明了這一點[29]。而SonoVue結合超聲能夠進一步提高轉染效率是因為超聲作用時產生的聲孔效應比作用于Optison的轉染過程更為明顯。故建議在基因轉染實驗中選用SonoVue、Optison及De fi nity等白蛋白或脂質體外殼，全氟化碳氣體的微泡造影劑更為適合。Li等[30]分別比較Optison、Imagent和De fi nity 3種超聲微泡對心肌血管通透性的作用，結果顯示，3種微泡對微血管損害的潛在性無明顯差異，僅De fi nity組有較多的微血管滲出。

由于UTMD介導轉染還受到造影劑給藥途徑、轉染部位、超聲儀器等因素的影響，對UTMD各方面影響因素的限定至今仍無法達成共識。

5 UTMD的安全性

自超聲造影劑問世以來，其安全性備受關注。2007年，FDA要求在超聲微泡造影劑標簽上加上黑框警告，以警告其有引起嚴重心肺反應的危險，因為有4例患者在注射造影劑當時或之后30min內死于心臟驟停，還有一些患者發生嚴重但非致死性的心肺并發癥。但一系列大規?；仡櫡治鯷31,32]證明了超聲微泡造影劑使用的安全性后，FDA修改了黑框警告。

UTMD技術所要求的超聲參數與診斷用超聲不同，為高聲強、低頻率、高強度超聲，會引起組織細胞不可逆的損傷[33,34]。此外，超聲聯合微泡所產生的空化作用，即在微泡破裂的瞬間所釋放出的巨大聲能與高溫，都會使組織細胞受損傷的風險大大增加，已有超聲聯合微泡引起組織出血、血管內溶血、體外培養細胞和含氣組織及器官損傷的報道[35]。并有學者認為UTMD還能通過局部產生自由基和微射流，引起血管內皮損傷，進一步損傷細胞和組織。

目前絕大多數學者認為UTMD較病毒轉染方式相對安全。Hynynen等[36]將去除部分顱骨的新西蘭兔作為實驗模型，采用超聲聯合微泡造影劑對實驗模型的腦部進行20s輻照，聲強為16 ～ 690W/cm2，實驗結果顯示，聯合微泡超聲局部輻照可使血-腦屏障短暫地、可逆地開放，并不引起損傷。此外，大多數關于UTMD的實驗多采用離體器官或細胞為研究對象，使用劑量遠大于臨床所需劑量。所以UTMD在藥物傳輸及基因轉染過程中對人體產生損傷的概率應該很低。

6 UTMD的應用前景

目前基因治療需要尋找一種安全、高效、可重復、靶向性強的轉運載體，而UTMD技術的出現正可以解決這個難題，雖然該技術的效率相對于病毒轉染方式很低，但是它克服了病毒轉染的細胞毒性及免疫原性問題，創傷小、安全性高，也可以直接攜帶藥物進行治療，在分子生物學中具有廣闊的應用前景。

[1]Lawrie A, Brisken AF, Francis SE, et al. Microbubbleenhanced ultrasound for vascular gene delivery. Gene Ther,2000, 7(23)： 2023-2027.

[2]Wang ZG, Ling ZY, Ran HT, et al. Ultrasound-mediated microbubble destruction enhances VEGF gene delivery to the infarcted myocardium in rats. Clinical Imaging, 2004,28(6)： 395-398.

[3]Guo DP, Li XY, Sun P, et al. Ultrasound/microbubble enhances foreign gene expression in ECV304 cells and murine myocardium. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2004, 36(12)： 824-831.

[4]王志剛．超聲微泡造影劑在疾病診斷與治療中的研究進展．中國醫學影像技術, 2005, 21(8)： 1148-1150.

[5]Hallow DM, Mahajan AD, McCutchen TE, et al.Measurement and correlation of acoustic cavitation with cellular bioeffects. Ultrasound Med Biol, 2006, 32(7)：1111-1122.

[6]Bekeredjian R, Chen S, Frenkel PA, et al. Ultrasoundtargeted microbubble destruction can repeatedly direct highly speci fi c plasmid expression to the heart. Circulation,2003, 108(8)： 1022-1026.

[7]康娟, 吳小翎, 張勇, 等. 載多西紫杉醇脂質微泡聯合超聲靶向微泡破裂對兔VX2肝癌微血管的作用. 中國介入影像與治療學, 2011, 8(5)： 431-434.

[8]Xie F, Tsutsui JM, Lof J, et al. Effectiveness of lipid microbubbles and ultrasound in declotting thrombosis.Ultrasound Med Biol, 2005, 31(7)： 979-985.

[9]Flores R, Hennings LJ, Lowery JD, et al. Microbubbleaugmented ultrasound sonothrombolysis decreases intracranial hemorrhage in a rabbit model of acute ischemic stroke. Invest Radiol, 2011, 46(7)： 419-424.

[10]Li XH, Zhou P, Wang LH, et al. The targeted gene (KDRPCD/TK) therapy of breast cancer mediated by SonoVue and ultrasound irradiation in vitro. Ultrasonics, 2012, 52(1)：186-191.

[11]Zhou S, Li S, Liu Z, et al. Ultrasound-targeted microbubble destruction mediated herpes simplex virus-thymidine kinase gene treats hepatoma in mice. J Exp Clin Cancer Res, 2010,29(1)： 170.

[12]Kou R, SenBanerjee S, Jain MK, et al. Differential regulation of vascular endothelial growth factor receptors(VEGFR) revealed by RNA interference： interactions of VEGFR-1 and VEGFR-2 in endothelial cell signaling.Biochemistry, 2005, 44(45)： 15064-15073.

[13]Luo J, Zhou X, Diao L, et al. Experimental research on wild-type p53 plasmid transfected into retinoblastoma cells and tissues using an ultrasound microbubble intensifier. J Int Med Res, 2010, 38(3)： 1005-1015.

[14]Zhong S, Shu S, Wang Z, et al. Enhanced homing of mesenchymal stem cells to the ischemic myocardium by ultrasound-targeted microbubble destruction. Ultrasonics,2012, 52(2)： 281-286.

[15]Xenariou U, Griesenbach U, Liang HD, et al. Use of ultrasound to enhance nonviral lung gene transfer in vivo.Gene Ther, 2007, 14(9)： 768-774.

[16]Huang Q, Deng J, Wang F, et al. Targeted gene delivery to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasoundinduced blood-brain barrier disruption. Exp Neurol, 2012,233(1)： 350-356.

[17]Takahashi M, Kido K, Aoi A, et al. Spinal gene transfer using ultrasound and microbubbles. J Control Release,2007, 117(2)： 267-272.

[18]Chen ZY, Liang K, Qiu RX. Targeted gene delivery in tumor xenografts by the combination of ultrasound-targeted microbubble destruction and polyethylenimine to inhibit survivin gene expression and induce apoptosis. J Exp Clin Cancer Res, 2010, 29(1)： 152.

[19]Chen Z, Liang K, Xie M, et al. Novel ultrasound-targeted microbubble destruction mediated short hairpin RNA plasmid transfection targeting survivin inhibits gene expression and induces apoptosis of HeLa cells. Mol Biol Rep, 2009, 36(8)： 2059-2067.

[20]Chen S, Shimoda M, Chen J, et al. Transient overexpression of cyclin D2/CDK4/GLP1 genes induces proliferation and differentiation of adult pancreatic progenitors and mediates islet regeneration. Cell Cycle, 2012, 11(4)： 695-705.

[21]Tang HL, Wang ZG, Li Q, et al. Targeted delivery of bone mesenchymal stem cells by ultrasound destruction of microbubbles promotes kidney recovery in acute kidney injury. Ultrasound Med Biol, 2012, 38(4)： 661-669.

[22]Du J, Shi QS, Sun Y, et al. Enhanced delivery of monomethoxypoly(ethylene glycol)-poly(lactic-co-glycolic acid)-poly l-lysine nanoparticles loading platelet-derived growth factor BB small interfering RNA by ultrasound and/or microbubbles to rat retinal pigment epithelium cells. J Gene, 2011, 13(6)： 312-323.

[23]Yamaguchi K, Feril LB Jr, Tachibana K, et al. Ultrasoundmediated interferon β gene transfection inhibits growth of malignant melanoma. Biochem Biophys Res Commun,2011, 411(1)： 137-142.

[24]Bekeredjian R, Kuecherer HF, Kroll RD, et al. Ultrasoundtargeted microbubble destruction augments protein delivery into testes. Urology, 2007, 69(2)： 386-389.

[25]Mayer CR, Bekeredjian R. Ultrasonic gene and drug delivery to the cardiovascular system. Adv Drug Deliv Rev,2008, 60(10)： 1177-1192.

[26]Rahim A, Taylor SL, Bush NL, et al. Physical parameters affecting ultrasound microbubble-mediated gene delivery efficiency in vitro. Ultrasound Med Biol, 2006, 32(8)：1269-1279.

[27]Zarnitsyn VG, Prausnitz MR. Physical parameters influencing optimization of ultrasound-mediated DNA transfection. Ultrasound Med Biol, 2004, 30(4)： 527-538.

[28]Wang XH, Liang HD, Dong B, et al. Gene transfer with microbubble ultrasound and plasmid DNA into skeletal muscle of mice： comparison between commercially available microbubble contrast agents. Radiology, 2005,237(1)： 224-229.

[29]Song S, Shen Z, Chen L, et al. Explorations of highintensity therapeutic ultrasound and microbubble-mediated gene delivery in mouse liver. Gene Therapy, 2011, 18(10)：1006-1014.

[30]Li P, Armstrong WF, Miller DL. Impact of myocardial contrast echocardiography on vaseular permeability：comparision of three different contrast agents. Ultrasound Med Biol, 2004, 30(1)： 83-91.

[31]Kusnetzky LL, Khalid A, Khumri TM, et al. Acute mortality in hospitalized patients undergoing echocardiography with and without an ultrasound contrast agent： Results in 18,671 consecutive studies. J Am coll Cardiol, 2008, 51(17)： 1704-1706.

[32]Dolan MS, Gala SS, Dodla S, et al. Safety and ef fi cacy of commercially available ultrasound contrast agents for rest and stress echocardiography a multicenter experience. J Am ColI Cardiol, 2009, 53(1)： 32-38.

[33]Kinoshita M, Hynynen K. A novel method for the intracellular delivery of siRNA using microbubbleenhanced focused ultrasound. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 335(2)： 393-399.

[34]Fang HY, Tsai KC, Cheng WH, et al. The effects of power on-off durations of pulsed ultrasound on the destruction of cancer cells. Int J Hyperthermia, 2007, 23(4)： 371-380.

[35]ter Haar GR. Ultrasonic contrast agents： safety considerations reviewed. Eur J Radiol, 2002, 41(3)： 217-221.

[36]Hynynen K, McDannold N, Vykhodtseva N, et al.Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology, 2001, 220(3)：640-646.

10.3969/j.issn.1005-5185.2012.11.021

同濟大學附屬東方醫院心臟中心 上海200120

陳 明 E-mail： mingchen1283@vip.163.com

2012-01-10

2012-08-03

（責任編輯 張春輝）