復方丹參滴丸增強氯吡格雷對高血脂癥小鼠血小板的抑制作用

姚麗梅，黃海定，朱偉*

(1.廣東食品藥品職業學院，廣東廣州5105202.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東省中醫藥科學院，廣東廣州510006)

中西藥聯用，在我國許多醫院已成臨床用藥的常規。有研究顯示:一些中藥和西藥合用會產生相互作用，因此，為了公眾的安全，有必要深入研究中西藥間相互作用［1-2］。氯吡格雷作為一種新型抗血小板藥物，已成為冠心病抗血小板藥物治療的基石［3］，復方丹參滴丸是丹參、三七及冰片組成的純中藥滴丸劑，目前已經在全國多家醫院廣泛用于多種心血管疾病［4-5］，因此這兩種藥物在臨床合并使用的情況比較普遍，但兩者是否存在相互作用、會不會影響臨床療效尚無專門的研究。本研究采用高血脂小鼠模型，觀察復方丹參滴丸對硫酸氫氯吡格雷抗血小板功能的影響，并探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物復方丹參滴丸(天津天士力制藥有限公司，批號:110317)，硫酸氫氯吡格雷(賽諾非安萬特(杭州)制藥有限公司，批號:2613)。

1.2 動物SPF級昆明種小鼠50只，雌雄各半，體質量18～22 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物許可證號為0086042。飼養于廣州中醫藥大學第二臨床醫學院動物實驗中心SPF級環境中，在恒溫(20±24)℃、恒相對濕度(50±5)%條件下飼養，環境設施許可證號:SYXK(粵)2008-0094。

1.3 試劑膽固醇、膽酸鈉購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司(批號:20110412);抗小鼠單克隆熒光標記抗體:CD41-PE-CY7，CD14-FITC，CD62P-PE;同型對照:Rat IgG1κ-PE-CY7，Rat IgG2aκ-FITC，Rat IgG1κ-PE等試劑均購自美國eBioscience公司;1%多聚甲醛、PBS緩沖液購自廣州聯科生物技術有限公司;溶血素C購自美國貝克曼庫爾特公司;血脂測定試劑盒購自寧波美康生物科技有限公司(批號:20110412)。

1.4 儀器FC—500流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司);Trilogy全自動血液生化分析儀(英國DREW公司)。

1.5 方法

1.5.1 動物分組及給藥先以基礎飼料適應性喂養7 d，將小鼠隨機分為5組，每組10只，基礎飼料組(NCG)喂飼基礎飼料;高脂飼料組(HCG)喂飼高脂飼料(高脂飼料配方如下:2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉、10%動物油、82.5%標準飼料，由廣東省醫學實驗動物中心加工制成);高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復方丹參滴丸組、高脂飼料+聯合用藥組。根據預實驗結果，各藥物治療組在造模第8周開始灌胃給藥，連續給藥2周。氯吡格雷的給藥量為21 mg/(kg·d)，復方丹參滴丸的給藥量為160 mg(生藥)/(kg·d)。小鼠自由攝食和飲水，每周稱量體質量1次，按體質量換算藥物的灌胃量，正常對照組灌服同體積蒸餾水。

1.5.2 血脂指標測定飼養結束后，停止喂食24 h，摘眼球取小鼠血，常規分離血清，以血脂試劑盒在全自動生化分析儀上測定小鼠總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.5.3 血小板活化檢測在流式專用上樣管中，分別加入CD14-FITC和CD62P-PE抗體1 μL，CD41-PE-CY7抗體1.5 μL，再加入小鼠抗凝外周血5 μL，避光孵育15～20 min，加入1 mL預冷(2～8℃)的1%多聚甲醛，2～4℃避光20 min，24 h內上機檢測。

1.5.4 單核細胞血小板聚集和中性粒細胞血小板聚集檢測在流式專用上樣管中，分別加入CD14-FITC抗體1 μL，CD41-PE-CY7抗體1.5 μL，再加入小鼠抗凝外周血50 μL，避光孵育15～20 min，加入溶血素C 500 μL，震蕩混勻，靜置待溶液透明，加入1 mL PBS混勻，上機檢測。用SS和CD14射門，分別收集單核細胞和中性粒細胞細胞5 000個，分別計算單核細胞和中性粒細胞細胞上CD41的表達百分率，分別表示單核細胞血小板聚集率和中性粒細胞血小板聚集率。

2 結果

2.1 各組小鼠體質量和血脂水平的情況與基礎飼料組相比，高血脂癥4組小鼠的體質量均明顯增加(P＜0.05)，見圖1。表1的數據顯示，高脂飼料組組小鼠血脂TC、TG和LDL-C均明顯高于基礎飼料組，各組HDL-C水平無顯著性差異，說明本實驗高血脂癥小鼠模型的建立是成功的。

圖1 各組小鼠體質量比較Fig.1 Comparison of mice weight in different groups

表1 不同組別小鼠血脂水平比較±s，n=10)Tab.1 Comparison of lipid levels in different groups of mice±s，n=10)

表1 不同組別小鼠血脂水平比較±s，n=10)Tab.1 Comparison of lipid levels in different groups of mice±s，n=10)

注:與基礎飼料組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高脂飼料組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與高脂飼料+復方丹參滴丸組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組別TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)基礎飼料組1.04±0.08 2.31±0.291.00±0.070.29±0.051.01±0.08高脂飼料組4.19±0.31＊＊1.33±0.10﹡0.52±0.09＊＊1.05±0.10高脂飼料+氯吡格雷組3.50±0.57＊＊△1.23±0.22﹡0.41±0.06＊＊△◇◇1.02±0.08高脂、高脂飼料+復方丹參滴丸組3.87±0.47＊＊1.30±0.12＊＊0.52±0.07＊＊1.00±0.08高脂飼料+聯合用藥組3.01±0.64＊△△◇◇1.12±0.13＊＊△△◇◇0.37±0.06＊＊△△◇◇

2.2 各組小鼠血小板功能的比較圖2和表2數據表明，與基礎飼料組比較，高脂飼料組的活化血小板比例、單核細胞血小板聚集率和中性粒細胞血小板聚集率都有顯著性增加(P＜0.01)，高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復方丹參滴丸組和高脂飼料+聯合用藥組的單核細胞血小板聚集率有顯著性增加(P＜0.01或P＜0.05)。與高脂飼料組相比，高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復方丹參滴丸組和高脂飼料+聯合用藥組的活化血小板比例有顯著性降低(P＜0.01)，高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復方丹參滴丸組和高脂飼料+聯合用藥組的中性粒細胞細胞血小板聚集率也有顯著性降低(P＜0.01或P＜0.05)，但高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復方丹參滴丸組和高脂飼料+聯合用藥組的單核細胞血小板聚集率的差異無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 流式細胞儀分析活化血小板(A)、單核細胞血小板聚集(B)和中性粒細胞血小板聚集(C)的散點圖Fig.2 Scatter plot of activated platelets(A)，monocyte-platelet aggregation(B)and neutrophilplatelet aggregation(C)by flow cytometry

表2 不同組別小鼠血小板表達比率比較(±s，n=10)Tab.2 Expression ratio comparison of platelets in different groups of mice(±s，n=10)

表2 不同組別小鼠血小板表達比率比較(±s，n=10)Tab.2 Expression ratio comparison of platelets in different groups of mice(±s，n=10)

注:與基礎飼料組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高脂飼料組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與高脂飼料+聯合用藥組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組別活化血小板/%單核細胞血小板聚集率/%中性粒細胞細胞血小板聚集率/%28.02±5.867.24±2.6319.87±4.34高脂飼料組45.75±6.94＊＊13.55±3.93＊＊32.77±5.95＊＊高脂飼料+氯吡格雷組32.48±4.74＊△△◇◇11.46±2.33＊＊24.74±4.67△◇高脂、高脂飼料+復方丹參滴丸組32.62±5.90△△◇◇10.69±2.64*23.00±4.62△△◇高脂飼料+聯合用藥組20.15±3.78＊△△11.16±1.82*19.37±3.13基礎飼料組△△

3 討論

血小板極易激惹活化，樣本經離心、洗滌等步驟，容易人為地導致體外血小板激活，影響檢測價值。本研究采用的全血法流式細胞術盡可能避免血小板體外醫源性激活，防止血小板亞群丟失，在檢測過程中不會受其它種類細胞或碎片的干擾，保證了檢測的特異性。本研究檢測指標CD62p是血小板活化的特異性分子標志物，它主要位于血小板的α顆粒膜上，同時存在于內皮細胞的Weibel-Palada小體膜上，CD62p在未活化的內皮細胞膜上有一定數量的基礎表達，在血小板活化時CD62p與血小板表面的質膜融合，并在血小板膜上表達或出現在血漿中［6］。

臨床和實驗研究表明，高脂血癥患者血小板活性增高，易發生心血管事件，其主要原因是高脂血癥損傷內皮結構和功能，使膠原暴露，促進血小板的黏附和激活;高血脂狀態下，血小板自身源源不斷地攝取膽固醇(TC)，結果血小板膜脂質中的膽固醇/磷脂比例高于正常，使血小板膜流動性降低，影響血小板膜功能;血小板膜上的鈣離子通道周圍脂質發生改變，鈣內流明顯增加，導致凝血活性增強［7-8］。血小板的活化、黏附、聚集以及血小板因子的釋放不但可直接觸發急性冠脈綜合征，而且還是動脈粥樣硬化的重要致病因素［9］，隨著人們對血小板在心血管疾病發展進程中關鍵作用的認識不斷深入，抗血小板藥物治療已經成為急性冠脈綜合征和冠狀動脈介入術等患者預防和治療的基石［10］，氯吡格雷則是臨床最常用的抗血小板藥物之一。近來許多研究發現，氯吡格雷與質子泵抑制劑或他汀類藥物合用會增加患者心血管不良事件的風險［11-12］，國內亦有關于中藥與氯吡格雷合用的研究［13-14］。作為活血化瘀代表性的中成藥，復方丹參滴丸常和氯吡格雷聯合使用，其目的在于解決氯吡格雷抵抗的問題，但這種聯合用藥缺少實驗數據，存在一定的安全性問題，值得開展研究。本研究結果表明復方丹參滴丸對高血脂癥小鼠體質量沒有影響，但可降低高血脂癥小鼠升高的總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇。高血脂癥小鼠的血小板處于高活化狀態，復方丹參滴丸和氯吡格雷均有抑制高血脂癥小鼠血小板活化的作用，兩者聯合使用具有協同效應，復方丹參滴丸能顯著增強氯吡格雷抑制血小板活性的作用。

總之，今后還需要大規模臨床試驗進一步探討復方丹參滴丸對氯吡格雷藥動學和藥效學的影響。另外，復方丹參滴丸與氯吡格雷之間的相互作用是否的確產生不良轉歸尚須進一步評價，因為藥理學上明顯的藥物間相互作用，不一定就會在臨床上產生影響。

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