龍膽瀉肝丸溶出特性研究

周永全，顧佳瑩，張寧

(上海中醫藥大學，上海201203)

龍膽瀉肝湯是收載于《醫方集解》中的著名經典方，由龍膽、柴胡、黃芩、梔子和澤瀉等十味藥組成，具有清肝膽實火，瀉下焦濕熱的功效。用于治療肝膽濕熱，頭暈目赤，耳鳴耳聾，耳腫疼痛，脅痛口苦，尿赤澀痛，濕熱帶下等癥。該方的特點是瀉中有補，降中寓升，去邪而不傷正，瀉火而不伐胃［1］。目前臨床上多使用的是丸劑、膠囊劑等固體劑型。固體制劑是通過藥物中有效成分的溶出、溶解并被吸收后發揮作用。各有效成分的溶出情況是影響藥物療效發揮的重要因素。丸劑是中藥傳統劑型之一，丸劑釋藥多以緩慢釋放為特點，復方中藥中多種成分由于其理化性質不同，其溶出速率存在著明顯差異，研究復方中藥中有效成分的溶出特性，對于復方中藥劑型選擇具有積極意義。本實驗對龍膽瀉肝丸中主要藥味中有效成分的溶出進行研究，并與膠囊劑的溶出進行比較，通過溶出模型擬合，探討其釋藥機理，從而為詮釋該制劑的藥劑學內涵提供實驗依據。

1 儀器與試藥

Zb—lc型智能崩解儀(天津大學精密儀器廠);FA2004N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司);CP225D型電子天平(Sartorius AG，上海精密科學儀器有限公司);Agilent—1200高效液相色譜系統(美國安捷倫公司);Thermo ODS—2 HYPERSIL C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(上海安譜科學儀器);Rcz—6C2型藥物溶出度儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)。

梔子苷對照品(批號110749-200714)、龍膽苦苷對照品(批號110772-201013)、黃芩苷對照品(批號110715-201016)、阿魏酸對照品(批號110773-200611)上述對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，定量測定用;龍膽瀉肝丸(洛陽順勢藥業有限公司，批號:20100902)、龍膽瀉肝膠囊(湖北福人藥業股份有限公司，批號:20101101)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 龍膽苦苷、黃芩苷、梔子苷［2］Thermo ODS-2 HYPERSIL C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);檢測波長254 nm;流動相為1%冰醋酸水溶液為流動相A、乙腈為流動相B;體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫;進樣量20 μL。

梯度洗脫流動相配比變化如表1所示。

表1 梯度洗脫流動相配比變化Tab.1 Variety of the mobile phase in gradient elution

龍膽瀉肝丸溶出液中龍膽苦苷、黃芩苷、梔子苷等成分色譜圖見圖1。

2.1.2 阿魏酸色譜柱(Thermo ODS-2 HYPERSIL C18柱4.6 mm×250 mm，5 μm);檢測波長321 nm;流動相為甲醇－1%冰醋酸(46∶54);體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫;進樣量20 μL。龍膽瀉肝丸溶出液中阿魏酸色譜圖見圖2。

圖1 龍膽瀉肝丸中梔子苷、龍膽苦苷、黃芩苷測定圖譜Fig.1 Chromatogram of jasminoidin，gentiopicrin and baicalin in Longdan Xiegan Pills

圖2 龍膽瀉肝丸中阿魏酸測定圖譜Fig.2 Chromatogram of ferulic acid in Longdan Xiegan Pills

2.2 系統適用性試驗

2.2.1 線性范圍考察分別精密稱取梔子苷、龍膽苦苷、黃芩苷的干燥對照品，加甲醇配制成每1 mL含梔子苷、龍膽苦苷、黃芩苷96.0、59.6、58.0 μg的混合對照品溶液;精密稱取阿魏酸的干燥對照品，加甲醇配制成每1 mL含阿魏酸40.0 μg的對照品溶液。

精密吸取混合對照品溶液，用甲醇依次稀釋制備其2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍系列質量濃度的對照品稀釋溶液，按2.1.1項測定;吸取阿魏酸對照品溶液5 mL，同前法用甲醇稀釋制備其2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍系列質量濃度的對照品稀釋溶液，按色譜條件2.1.2項測定。以各成分質量濃度C為橫坐標，相應峰面積A為縱坐標進行回歸，梔子苷、龍膽苦苷、黃芩苷、阿魏酸的回歸方程分別為A=12.46C－7.577、A=16.89C－3.789、A=21.28C－15.25、A=108.6C－9.697;相關系數分別為0.999 9、0.999 4、0.999 8、0.999 7;線性范圍分別為1.50～96.0 μg/mL、0.931～59.6 μg/mL、0.906～58.0μg/mL、0.313～40.0 μg/mL。

2.2.2 精密度試驗精密吸取上述各對照品溶液20 μL，分別注入高效液相色譜儀，重復測定6次，記錄各成分的峰面積值，算得梔子苷、龍膽苦苷、黃芩苷、阿魏酸的RSD值分別為1.34%、1.65%、1.57%、0.83%。

2.2.3 穩定性試驗精密吸取各對照品溶液20 μL，分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h注入高效液相色譜儀測定，記錄各成分的峰面積值，算得梔子苷、龍膽苦苷、黃芩苷、阿魏酸的RSD值分別為1.94%、1.77%、3.27%、1.75%。

2.2.4 丸和膠囊中4種成分的溶出量測定結合參考文獻，本實驗采用直接測定成分含有量的方法而最終計算出該值［3］。稱取龍膽瀉肝丸和膠囊，分別約為0.5 g和0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%的甲醇50 mL，密塞，稱定質量。超聲處理(250 W，50 kHz)20 min，放冷，再稱質量，補足減失的質量，搖勻，以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，參照2.1項進行測試。

龍膽瀉肝丸中梔子苷、龍膽苦苷、黃芩苷、阿魏酸的質量分數分別為4.24、5.59、4.98、1.56mg/g;龍膽瀉肝膠囊中梔子苷、龍膽苦苷、黃芩苷、阿魏酸的質量分數分別為6.36、7.00、1.01、2.66 mg/g。

2.3 溶出度考察

2.3.1 溶出條件的選擇參考《中國藥典》2010年版(二部)溶出度測定法，采用漿法;溫度恒定在(37±0.5)℃，轉速為100 r/min;4 h內的溶出介質采用新配的人工胃液。

2.3.2 溶出度的測定與結果龍膽瀉肝丸:取新配制的人工胃液，超聲，精密量取675 mL加入溶出杯中，恒溫至(37±0.5)℃。取4份龍膽瀉肝丸，每份約4 g，精密稱定后放入溶出杯中，蓋緊杯蓋，啟動轉漿，轉速100 r/min。分別在開啟后15、30、45、60、90、120、180、240 min時，迅速吸取約2 mL溶出液(同時補充溶出介質2 mL)，以0.22 μm微孔濾膜過濾后進HPLC檢測。

龍膽瀉肝膠囊:取龍膽瀉肝膠囊8粒(含藥約2 g)于溶出杯中，溶出條件、取樣點、樣品處理方法同龍膽瀉肝丸。

對上述每個時間點累積溶出量進行校正后除以百分之百溶出量得相對累積溶出率，結果見表2、表3。

表2 龍膽瀉肝丸中各成分相對累積溶出率(%，n=4)Tab.2 Cumulative dissolution percentage of the 4 compounds in Logdan Xiegan Pills(n=4)

表3 龍膽瀉肝膠囊中各成分相對累積溶出率(%，n=3)Tab.3 Cumulative dissolution percentage of the 4 compounds in Longdan Xiegan Capsules(n=3)

由表2和表3可見，膠囊中各成分的溶出較丸劑快;丸劑中梔子苷和龍膽苦苷溶出比黃芩苷和阿魏酸快，2 h時，梔子苷和龍膽苦苷溶出約85%、黃芩苷和阿魏酸溶出約45%，之后溶出速度有所減緩;膠囊劑在0～30 min溶出較快，30 min以后溶出曲線趨于平緩，至2 h時溶出率達到99%(除阿魏酸)。

龍膽瀉肝丸中，各指標成分的溶出情況比較結果見圖3。

圖3 龍膽瀉肝丸中主要藥效成分溶出曲線Fig.3 Dissolution curves of the effective composition in Longdan Xiegan Pills

從4種成分4 h的釋放曲線可以看出，梔子苷和龍膽苦苷的溶出行為較為接近，明顯比黃芩苷和阿魏酸釋放的快且完全，這表明梔子和龍膽中的這兩種成分更容易被吸收、起效。

龍膽瀉肝丸劑與膠囊劑中各指標成分的溶出情況比較結果見圖4～圖7。

從丸劑與膠囊劑溶出情況看，丸劑中4種成分的溶出速度均比膠囊劑的慢，但至4 h時，丸劑中梔子苷、龍膽苦苷的溶出程度基本與膠囊劑相同而黃芩苷、阿魏酸的溶出程度明顯低于膠囊劑。

2.3.3 溶出模型擬合本實驗采用Excel(DEBS法)［4］，從目前常用于緩控釋制劑的釋藥動力學方程中，選擇以下5種溶出模型對龍膽瀉肝丸的釋放分別進行擬合:

圖4 梔子苷溶出度比較曲線圖Fig.4 Dissolution curves of jasminoidin

圖5 龍膽苦苷溶出度比較曲線圖Fig.5 Dissolution curves of gentiopicrin

圖6 黃芩苷溶出度比較曲線圖Fig.6 Dissolution curves of baicalin

圖7 阿魏酸溶出度比較曲線圖Fig.7 Dissolution curves of ferulic acid

零級反應模型:Mt/M0=kt+b(k、b為所求參數)

一級反應模型:Mt/M0=1－EXP(－kt+b)(k、b為所求參數)

Higuchi模型:Mt/M0=k×t1/2+b(k、b為所求參數)

Ritger-Peppas模型:Mt/M0=k×tm+b(k、b、m為所求參數)

Weibull模型:Mt/M0=1－EXP(－(t－τ)m/t0)(τ、t0、m為所求參數)

其中，Mt/M0為溶出百分率、t為時間。

擬合結果如表4所示(表中的時間t均以min為單位):

表4 龍膽瀉肝丸4種成分溶出模型擬合結果Tab.4 Results of fitting dissolution models for 4 compounds in Longdan Xiegan Pills

由擬合結果可知，上述4種成分的溶出以用Weibull模型擬合最好，但一級反應模型、Higuchi模型、Ritger-Peppas模型擬合的相關系數也較高;據Ritger-Peppas模型數據判斷，上述4種成分的溶出過程均不符合完全的骨架溶蝕機制(m＞0.89者)，黃芩苷和阿魏酸為非Fick＇s擴散(0.45＜m＜0.89者，擴散與溶蝕并存);梔子苷和龍膽苦苷為Fick＇s擴散(m＜0.45者)。

3 討論

本實驗對龍膽瀉肝丸中4種有效成分的體外溶出度進行了研究，結果表明:4 h時，丸中龍膽苦苷、梔子苷溶出較完全，而黃芩苷、阿魏酸分別溶出66.51%、61.68%，可見龍膽苦苷、梔子苷的溶出快于黃芩苷和阿魏酸。

溶出模型擬合結果表明:上述4種成分的溶出均以用Weibull模型擬合效果最佳，提示其溶出速率常數與擴散系數成正比，且隨時間變化而變化，而介質的溫度、體積等在溶出過程中均未改變，據上述可推測龍膽瀉肝丸的溶出機制可能為非溶蝕的Fick＇s擴散。Ritger-Peppas模型擬合結果也表明龍膽苦苷和梔子苷按Fick＇s擴散機制溶出而黃芩苷和阿魏酸為非Fick擴散(擴散與溶蝕并存)，但前兩者溶出較快(梔子苷、龍膽苦苷的Td值分別為65.7、67.6 min，黃芩苷、阿魏酸的Td值207、235min)，這4種成分的水溶性也有所不同:梔子苷易溶于水(溶解度大于10 g)、龍膽苦苷可溶于水(溶解度約為7.65 g)［5］，其油水分配系數較小;黃芩苷、阿魏酸(主要是反式阿魏酸)的溶解度則較小(溶解度均小于0.1 g)［6-7］，且兩者均顯酸性［8］，其在酸性環境下的溶解度較小。而目前一般認為藥物的溶解速率與藥物溶解度成正相關［9］，這可能是梔子苷、龍膽苦苷溶出更快的原因之一。

另外，Ritger-Peppas模型中的位置參數τ的意義是溶出延遲時間，其取值應在0～15 min(第1次取樣時)之間，但研究發現:其取負值時相關系數更高，且在4個成分中有共性，這可能與取樣等操作占用時間、各成分有一定水溶性等因素有關。

采用f2因子法考察溶出相似度，結果顯示:丸劑中，梔子苷與龍膽苦苷的f2值為90，梔子苷與黃芩苷、阿魏酸的f2值分別為29、27，龍膽苦苷與黃芩苷、阿魏酸的f2值分別為30、27，黃芩苷與阿魏酸的f2值分為72，可以認為梔子苷與龍膽苦苷的溶出具有高度相似性、釋放同步，黃芩苷與阿魏酸的溶出具有相似性、釋放同步。

中藥傳統丸劑由于發揮作用慢，一般被認為是“緩釋”制劑，在對龍膽瀉肝丸及膠囊中4個成分釋藥行為的研究中發現，丸劑中上述成分在開始階段溶出速率均慢于膠囊，但有些成分在后續階段的溶出度與膠囊接近(如龍膽苦苷和梔子苷)，可能是由于丸劑中加入的輔料阻礙了這些成分向水中擴散而影響其溶出，使該溶出過程與現代藥劑學中某些由“骨架材料”制備的緩釋制劑的溶出有類似之處，這也證實了中醫藥理論中“丸者緩也”的論述。實驗中還發現丸中各種成分的溶出具有不同步性，這種差異與溶解度相關。

中藥是復雜體系，丸劑作為中藥傳統劑型，其溶出特點有必要進行深入研究，本實驗僅選擇4種成分，有一定局限性，尚應借鑒一些新技術和方法(如定量指紋圖譜、Kalman濾波法等基于組分學說的模糊類評價的方法等［10］)以建立多個活性部位成分溶出(或釋藥)行為的考察。此外，本實驗只是對藥物在胃內溶出的一個體外模擬實驗，與體內吸收存在一定差異性，藥物在體內的吸收還與成分狀態、多種酶的作用、跨生物膜性質、腸道吸收狀況等多種因素有關。例如黃芩苷在堿性的腸道中溶出量理論上較大，但呈離子態增多而吸收減少，故黃芩苷的吸收主要在胃內，而其水溶性、脂溶性均較差，故其生物利用度較低［11］;而龍膽苦苷、梔子苷溶出雖較為順利，但由于其水溶性大、龍膽苦苷透膜性差而梔子苷存在首過效應，故這兩者的口服絕對生物利用度也較低(小于10%)［12-13］。因此在體外溶出度研究的基礎上，還應結合藥理效應或生物效應等指標，才能解析中藥丸劑劑型的科學內涵。

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