山楂總黃酮的逆流提取研究

戴曉燕，余陳歡，吳巧鳳*

(1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江杭州310053;2.浙江省醫學科學院，浙江杭州310013)

山楂系薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實，具有健胃消食，行氣散瘀之功效，屬于我國藥食同源的傳統中藥材。現代研究表明，黃酮類物質為山楂的主要活性成分［1］，含有量較高［2］，能夠起到助消化［3］、降血脂［4］、保肝［5］、強心［6］及抗氧化［7］等作用。山楂在醫用藥品及保健品方面的開發利用較頻繁，它的價值往往體現于其加工產品的附加值上，故加強山楂有效物質的產業化提取十分必要。目前，山楂黃酮的提取方法包括有熱回流法、水煎法及滲漉法等方法，其中以熱回流法最為常用，但這些方法存在著提取率低、提取時間長、溶劑用量大、后續工段能耗大等缺點［8］。逆流提取是一種基于傳統單罐提取發展起來的新型提取方法，研究表明，該方法可確保藥材與溶劑之間始終保持較大的有效成分濃度差，可大大增加提取效率［9］。本研究擬采用三級逆流提取、三效逆流提取工藝模型的實驗室模擬方法及常規回流提取方法提取山楂總黃酮，并客觀地將3種方法進行比較和評價，確定山楂總黃酮的最適提取方法，以期為山楂黃酮相關產品的產業化生產提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器UV—2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)，UV probe紫外工作站;HH—S型恒溫水浴鍋(鞏義市瑛峪予華儀器廠);0412—1型高速離心機(上海手術器械廠);BS110S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);DHG—9035熱風循環烘箱(上海林頻儀器設備有限公司)，WND—200A型高速中藥粉碎機(上海微型電機廠)。

1.2 試藥蘆丁對照品(批號:100226)購自中國藥品生物制品檢定所;山楂飲片(產地:山東;批號:111118)購自浙江中醫藥大學飲片廠，經浙江中醫藥大學俞冰副教授鑒定屬薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實;所用試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 不同提取方法提取山楂總黃酮

2.1.1 三級逆流提取精密稱取干燥至恒定質量的山楂飲片3份，各10.0 g，分別置于3個圓底燒瓶中，以60%乙醇為提取溶媒，按照三級逆流提取工藝進行提取。具體方法如圖1所示，第1階段山楂飲片被提取3次，每次均加入新鮮溶媒50 mL，得溶液E1-1、E1-2、E1-3，其中E1-1儲存。第2階段提取，溶液E1-2、E1-3分別作為第1次、第2次提取的溶媒，得溶液E2-1、E2-2，其中E2-1儲存;第3次則采用新鮮溶媒提取第2次所得藥渣，得溶液E2-3。第3階段，溶液E2-2、E2-3分別作為第1、第2次提取的溶媒，得溶液E3-1、E3-2均儲存;第3次采用新鮮溶媒提取第2次所得藥渣，得溶液E3-3儲存。每階段每次提取溫度為80℃，提取時間20 min。最后合并各所得溶液，放涼得最終提取液。該提取方法平行試驗3次。

圖1 三級逆流提取過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of three-stage countercurrent extraction

2.1.2 三效逆流提取平行精密稱取干燥至恒定質量的山楂飲片5份，各6.0 g，分別置于5個圓底燒瓶中以60%乙醇為提取溶媒，按照三效逆流提取工藝進行提取。具體提取方法如圖2所示，方框中1-12分別代表第1至12提取步驟，方框上方符號代表每步驟所加入的溶媒，左側符號代表被提取物，如:步驟1為加入新鮮提取溶媒與新鮮飲片進行提取;步驟2為新鮮提取溶媒與步驟1所得藥渣進行提取，依此類推。每步提取溫度為80℃，提取時間為15 min，凡需加入新鮮溶媒時其加入體積均為30 mL。最后合并各所得溶液，放涼得最終提取液。該提取方法平行試驗3次。

圖2 三效逆流提取過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of three-effect countercurrent extraction

2.1.3 常規回流提取精密稱取干燥至恒定質量的山楂飲片30 g，置圓底燒瓶中，加入60%乙醇溶液300 mL，80℃熱回流5 h，傾出放涼得最終提取液。該提取方法平行試驗3次。

2.2 總黃酮的定量測定

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒定質量的蘆丁對照品5.58 mg置于25 mL量瓶中，以60%乙醇稀釋至刻度線，搖勻，得質量濃度為0.223 2 mg/mL的蘆丁對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備量定2.1項下各最終提取液體積，均量取120 mL提取液濃縮至50 mL，以4 000 r/min的轉速高速離心10 min，傾出上清液并將濃縮液用60%乙醇溶液定容成100 mL，備用。

2.2.3 檢測波長的選擇精密吸取對照品溶液1.0 mL于25 mL量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min后加入10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min后再加入10%NaOH溶液10 mL，搖勻后用60%乙醇溶液稀釋至刻度線，放置15 min后，在波長400～600 nm范圍內進行掃描，每隔10 nm測定吸光度。結果發現溶液在510 nm處的吸光度值最大，故本實驗選擇510 nm為檢測波長。

2.2.4 標準曲線的建立精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL的量瓶中，同2.2.3項下方法顯色后，作同行試劑空白對照測定吸光度，以吸光度A為縱坐標Y，以蘆丁質量濃度C(mg/mL)為橫坐標X，繪制標準曲線，得回歸方程:Y=13.064X－0.022 9(R=0.999 6)。結果表明，蘆丁在0.004 464～0.044 64 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗精密吸取對照品溶液2.0 mL，依2.2.3項中方法顯色后于510 nm波長處連續測定6次吸光度。結果RSD為1.67%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復性試驗精密稱取山楂飲片，依照2.1項下各方法提取，并按2.2.2項下方法制備供試品溶液各6份，同2.2.3項中方法顯色后分別測定吸光度。結果RSD分別為1.15%、0.74%、0.97%，表明方法的重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗精密吸取供試品溶液0.3 mL，依2.2.3項下方法顯色后，每隔5 min測定吸光度，結果RSD為1.43%，表明溶液在30 min內顯色穩定。因此，吸光度的測定應控制在30 min以內進行。

另精密吸取0.3 mL供試品溶液分別于0、1、2、3、4、5、6 h后，按2.2.3項下方法顯色后測定吸光度，結果RSD為2.28%，表明供試品溶液在6 h內穩定。

2.2.8 加樣回收試驗適量量取已知總黃酮量的山楂提取液9份，分別精密加入相當于溶液中總黃酮含有量80%、100%及120%的蘆丁標準品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，并依2.2.3項下方法顯色后，測定吸光度，計算回收率，結果平均回收率為99.68%，RSD為1.60%，符合要求，見表1。

2.2.9 山楂總黃酮提取得率精密量取供試品溶液0.2 mL，依2.2.3項下方法顯色，測定吸光度，代入回歸方程計算總黃酮含有量，并進一步算得提取得率。

2.3 不同提取方法的比較為客觀地比較不同提取方法，對上述各提取方法的飲片用量、溶劑用量、總提取時間及提取得率進行了羅列，見表2。

表1 加樣回收試驗測定結果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

表2 不同提取方法藥材用量、溶劑用量、提取時間及提取得率Tab.2 Usage，solvent usage，extract time and extract yield of different extract methods

由表2可知，三級逆流、三效逆流提取方法與常規回流提取方法相比，三者的總黃酮提取得率相當，但前兩種提取方法的溶劑消耗量明顯下降，其中三效逆流提取的溶劑消耗量僅為常規回流提取方法的1/2;較之常規回流提取，兩種逆流提取方法的提取時間也大大縮短，為常規回流提取方法的3/5。表明逆流提取方法具有提取效果好、節省溶劑、節約實驗成本以及縮短提取時間等優點，將逆流提取方法引入山楂黃酮類物質的實驗室提取或推廣至山楂黃酮相關產品的產業化生產均有可助于工作效率的大幅度提高。

為進一步說明逆流提取方法具有較高的提取效率，另取山楂飲片3份，各10 g，分別采用三級逆流、三效逆流及常規回流提取方法，以60%乙醇為溶劑，控制三者的總提取時間均為1 h，總溶劑用量均為100 mL，提取溫度均為80℃，提取山楂中總黃酮。提取結束放涼后，取各提取液20 mL，以60%乙醇定容至50 mL量瓶中。采集用不同方法提取并定容后所得溶液的圖像(見圖3)，運用Imagepro Plus 6.0(專業圖像分析軟件6.0)對各圖像進行參數分析。

結果各溶液圖像的像素密度大小依次為三效逆流(132.67)＞三級逆流(115.66)＞常規回流(92.67)，表明在相同的提取條件下，逆流提取能更有效地使藥材中的溶質擴散至溶劑中。

圖3 不同提取方法所得提取液圖像Fig.3 Solution images of different extract methods

3 討論

藥材有效成分的提取過程是溶質從固相藥材高濃度向液相低濃度滲透的傳質過程。有效成分的提取浸出擴散力來源于提取溶媒與固相藥材組織內有效成分的濃度差，濃度差越大，擴散傳質的動力越大，浸出速度越快，有效成分浸出率越大［10］。逆流提取方法可始終保持兩相間較大的濃度梯度，從而維持較好的提取推動力來達到提高提取效率的目的。本實驗分別采用了傳統回流提取與兩種逆流提取方法來提取山楂中總黃酮，結果顯示逆流提取可大大減少提取的溶劑用量和時間，在節省提取成本的同時也保證了提取的質量，且對提取設備無過高要求，既適合推廣應用于山楂黃酮類相關藥品、食品的生產也適用于實驗室的中藥成分提取。此外，考慮實際生產或實驗的方便性及可操作性，與三效逆流相比之下，三級逆流提取的操作步驟相對簡便，亦能較好的提高提取效率，值得進一步推廣應用。

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