柱前衍生化HPLC法測定丹紅注射液氨基酸

裴玉，肖雪，付嬋，應旭輝，梁瓊麟，王義明，羅國安1，*

(1.江西中醫學院研究生部，江西南昌330004;2.南開大學藥學院，天津300071;3.清華大學分析中心，北京100084)

丹紅注射液是由傳統的活血化瘀中藥丹參、紅花提取的復方制劑。臨床上丹紅注射液用于冠心病、心絞痛、心肌梗死、瘀血型肺源性心臟病(肺心病)、腦血管疾病、萎縮性胃炎以及高血壓腎病等［1］。氨基酸類化合物作為一類常見的大類成分，在以往的中藥注射液研究中常被忽視，本試驗為更準確地控制丹紅注射液質量，對其所含氨基酸進行測定。本試驗采用了OPA-FMOC聯用柱前衍生HPLC法［2-4］，進行了氨基酸定量測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器Agilent 1200液相色譜儀，包括在線真空脫氣機，二元梯度泵，DAD檢測器，柱溫箱，自動進樣器(美國Agilent公司);Agilent ChemStation工作站;XP205型十萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司);Millipore Elix 5超純水儀(美國Millipore公司)。

1.1.2 試藥醋酸鈉、氫氧化鈉、硼酸、36%醋酸、四氫呋喃、三乙胺(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);水為超純水;乙腈、甲醇(色譜純，J.T Baker公司);FOMC、OPA、巰基丙酸及各氨基酸標準品:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，純度≥99.0%，均購自Sigma公司。

1.1.3 樣品丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司提供，批號為100412、100413、100414、100415、100416、100417、100418、100419)。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

OPA衍生試劑配制精密稱取OPA 40 mg，加入0.4 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 10.4)3.5 mL，乙腈0.5 mL，巰基丙酸63 μL，混勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

FOMC衍生試劑的配制精密稱取9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)25 mg，加入5 mL乙腈溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

氨基酸混合標準品溶液的配制精密稱取各氨基酸標準品適量，以1%HCl溶液定容至100 mL。單個氨基酸在混合標準液中的質量濃度如下:天冬氨酸0.107 8 mg/mL，谷氨酸0.895 2 mg/mL，天冬酰胺0.064 0 mg/mL，絲氨酸0.053 6 mg/mL，甘氨酸0.162 8 mg/mL，蘇氨酸0.068 7 mg/mL，胱氨酸0.104 1 mg/mL，丙氨酸0.142 6 mg/mL，精氨酸0.147 9 mg/mL，酪氨酸0.041 7 mg/mL，甲硫氨酸0.040 9 mg/mL，纈氨酸0.533 0 mg/mL，色氨酸0.051 0 mg/mL，苯丙氨酸0.206 0 mg/mL，異亮氨酸0.452 0 mg/mL，亮氨酸0.282 0 mg/mL，脯氨酸0.456 0 mg/mL;臨用前使用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

總氨基酸供試液的配制分別取各注射液1 mL于具塞試管中，加入6 mol/L鹽酸9 mL，氮封后蓋緊瓶蓋，110℃恒溫水解24 h;水解液70℃水浴蒸干，后加入1%鹽酸2 mL，超聲10 min，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.2.2 色譜條件本實驗室經過摸索建立了一個切實可行的測定氨基酸的方法，已在《鄰苯二甲醛-9-氯甲酸芴甲酯柱前衍生HPLC法測定血必凈注射液中氨基酸》［5］有所應用。具體方法如下:Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相A為0.02 mol/L醋酸鈉溶液(含200 μL/L三乙胺和3.5 mL/L四氫呋喃，2%醋酸溶液調pH 7.2±0.05)，流動相B為0.02 mol/L醋酸鈉溶液-甲醇-乙腈(200∶400∶400)(pH 7.2±0.05);柱溫40℃;檢測波長、洗脫梯度及體積流量見表1。進樣量:20 μL。

表1 流動相梯度順序Tab.1 Gradient elution program

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察采用1.2.2項下色譜條件得到混合標準品溶液色譜圖及丹紅注射液水解氨基酸色譜圖，見圖1。

圖1 混合標準品(A)和丹紅注射液樣品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference solution(A)and Danhong Injection(B)

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗取氨基酸混合標準品溶液，按2.2項下色譜條件，連續進樣6次，記錄各氨基酸色譜峰的保留時間和峰面積，并計算RSD，各氨基酸的RSD均小于0.41%，結果表明精密度良好，結果見表2。

表2 精密度、穩定性試驗結果(n=6)Tab.2 Results of precision test and stability test(n=6)

2.2.2 穩定性試驗取氨基酸混和標準品溶液，按2.2項下色譜條件進樣分析，分別于0、2、4、8、12、24 h時進樣，記錄各氨基酸色譜峰的保留時間和峰面積，并計算其RSD，各氨基酸的RSD均小于2.63%，結果表明樣品24 h內穩定性較好，結果見表2。

2.2.3 線性范圍本試驗考察了從母液到稀釋30倍樣品的一系列質量濃度梯度，結果見表3。從結果可見，各氨基酸在其質量濃度范圍內，線性關系良好。

表3 各氨基酸線性質量濃度范圍Tab.3 Linear equations and linear ranges

2.2.4重復性試驗取某一批丹紅注射液水解液，濾過，平行操作，配制4個樣品，進樣。結果各氨基酸的RSD小于4%，重復性良好。見表4。

表4 重復性試驗結果Tab.4 Results of reproducibility test

2.2.5 加樣回收率實驗取同一批丹紅注射液，稀釋10倍，水解后濾過，按樣品制備方法平行制備9份樣品，按照80%，100%，120%的比例加入數個標準品(谷氨酸、脯氨酸等)，按2.2項下條件測定，計算加樣回收率，結果見表5。

根據結果可知，各氨基酸加樣回收率均在95%～105%之間，說明該方法準確度和精確度高，方法可靠。

2.3 結果丹紅注射液氨基酸定量測定采用了HPLC柱前衍生化法，先用衍生試劑與氨基酸進行衍生化反應，然后再用紫外檢測器對其進行檢測，其色譜圖見圖1。測定了7批丹紅注射液，結果見表6，7批丹紅注射液水解氨基酸測定平均值為1.680 mg/mL。可以看到:丹紅注射液經過水解后，質量濃度最大的為谷氨酸，其次為脯氨酸、亮氨酸、纈氨酸等;質量濃度較小的組氨酸、精氨酸及蛋氨酸，其質量濃度均小于0.002 mg/mL。本實驗檢測到谷氨酸、脯氨酸等氨基酸的質量濃度RSD較大，提示丹紅注射液質量穩定性有待提高。本試驗所建立的HPLC分析方法對氨基酸的檢測選擇性好、分離度高、重復性強，可用于丹紅注射液中氨基酸的檢測及質量控制。

表5 主要氨基酸回收率試驗結果Tab.5 Results of recovery test

表6 樣品測定結果Tab.6 Results of Danhong Injection samples

3 討論

按照國家中藥注射液安全再評價標準:“多成分制成的注射劑，所測成分應大于總固體量的80%;而經質量研究明確結構的成分，應當在指紋圖譜中得到體現，一般不低于已明確成分的90%”。丹紅注射液中含有多種氨基酸，其量約占總固體的5.9%(測定丹紅注射液總固體量均值為28.33 mg/mL)，因此測定其中氨基酸的含有量勢在必行。當前中藥注射液的不良反應中以過敏反應［6-10］最為明顯，引起過敏的異體蛋白可能和其中所含結合氨基酸［11-12］有關。本實驗中氨基酸類成分研究可為更好地探究中藥注射液的物質基礎提供依據，以期達到臨床安全用藥的目的。

致謝本試驗所需樣本均有菏澤步長制藥有限公司提供，對參與該項工作的該公司質檢部王臣臣、管雪梅、郭曉光及生產車間等人員一并感謝。

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