LC-MS/MS 測(cè)定正骨水中3種烏頭類(lèi)生物堿的方法研究

劉吉成，周嵩煜

(1.廣西玉林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西玉林537000;2.廣西南寧食品藥品檢驗(yàn)所，廣西南寧530001)

正骨水由九龍川、木香、海風(fēng)藤、草烏等二十六味中藥提取而成，具有活血祛瘀，舒筋活絡(luò)，消腫止痛之功效，用于跌打扭傷，骨折脫位以及體育運(yùn)動(dòng)前后消除疲勞等［1］;因其中草烏藥材含有烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等酯型生物堿成分，這些生物堿既是有效成分又是毒性成分，藥材的炮制方法和產(chǎn)地及采收時(shí)間不同，其毒性成分量差異較大［2-3］，使用中若有不慎即可引起中毒，甚至死亡［4］。目前對(duì)含有烏頭類(lèi)藥材的中成藥研究中，多數(shù)僅控制了烏頭堿的限度［5］，但該類(lèi)藥物中還含有次烏頭堿和新烏頭堿也屬于雙酯型生物堿，應(yīng)與烏頭堿一起加以控制。由于正骨水遠(yuǎn)銷(xiāo)新加坡、馬來(lái)西亞等東盟各國(guó)，在一些國(guó)家進(jìn)出口過(guò)程中要求提供烏頭類(lèi)生物堿的檢測(cè)方法和限度標(biāo)準(zhǔn)，由于《中國(guó)藥典》2010年版一部中沒(méi)有這方面的規(guī)定，本試驗(yàn)采用LC-MS/MS測(cè)定正骨水中的烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿，方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠?qū)φ撬峁┯行У馁|(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制。

1 儀器和試劑

1.1 儀器Waters2695高效液相-Quattro MicroTMAPI質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司);LC/MS20-1氮?dú)獍l(fā)生器(英國(guó)Domnick hunter公司);K280R高速冷凍離心機(jī)(英國(guó)森特恩);Hei-VAPA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Heidolph公司);XS-205DU電子分析天平(梅特勒-托利多)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試劑乙腈、正己烷、甲酸為色譜純，水為超純水，乙醚，氨水等均為分析純。烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為:110720-200410，110798-200404，0799-9403;正骨水由廣西玉林制藥有限公司提供，批號(hào)為:20110117、211174、211175、211233。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［3，6］XTerraMS?C18色譜柱，5 μm，2.1 mm×150 mm，柱溫35℃，體積流量0.25 mL/min，流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L醋酸胺(含0.1%甲酸)(35∶65)，進(jìn)樣量20 μL。在上述條件下對(duì)照品3種成分各定量離子的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 3種烏頭類(lèi)生物堿對(duì)照品溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the three kinds of aconitine alkaloids in standard solution

2.2 質(zhì)譜條件［6-8］電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓1.8 kV;離子源溫度120℃;脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣氮?dú)怏w積流量為850 L/h;錐孔氮?dú)怏w積流量為100 L/h;碰撞氣為氬氣，質(zhì)量分析器為四級(jí)桿;定性離子對(duì)，定量離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量見(jiàn)表1。

2.3 供試品溶液的制備［9-12］精密量取本品50 mL，置100 mL平底燒瓶中，在40℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，剩余液體約10 mL轉(zhuǎn)移到50 mL具塞離心管中，用氨水5 mL洗滌平底燒瓶，洗滌液體一并轉(zhuǎn)入50 mL具塞離心管中，加15 mL乙醚洗滌平底燒瓶，一并轉(zhuǎn)入50 mL具塞離心管中，渦旋振搖提取1 min，6 000r/min離心10min，把乙醚層轉(zhuǎn)移到100 mL平底燒瓶中，反復(fù)用乙醚提取3次，每次15 mL，合并乙醚液至100 mL平底燒瓶中，于35℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸干乙醚，殘?jiān)芗尤? mL1%甲酸，2 mL正己烷，超聲2 min，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，渦旋振搖，離心，取下層水相過(guò)濾即得，供試品圖譜見(jiàn)圖2。

表1 3種烏頭類(lèi)生物堿質(zhì)譜條件參數(shù)Tab.1 Mass spectreometry parametres of the three kinds of aconitine alkaloids

圖2 供試品溶液中3種烏頭類(lèi)生物堿MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of the three kinds of aconitine alkaloids in sample solution

2.4 對(duì)照品溶液的制備取烏頭堿對(duì)照品11.40 mg、次烏頭堿13.28 mg、新烏頭堿9.95 mg各置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取1 mL，置同一100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度作為混合對(duì)照品貯備液。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察精密量取混合對(duì)照品貯備液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程分別為:烏頭堿:Y=47.374 2X－0.136 0(r=0.999 97);次烏頭堿:Y=78.384 6X－23.14(r=0.999 93);新烏頭堿:Y=66.887 4X－16.69(r=0.999 70)。結(jié)果表明烏頭堿在1.14～57.0 ng/mL、次烏頭堿在1.328～66.40 ng/mL，新烏頭堿在0.995～49.75 ng/mL范圍線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn)取不加草烏制備的供試品溶液，按照上述2.3項(xiàng)下供試品處理過(guò)程處理，制備空白供試品溶液，結(jié)果空白樣品中沒(méi)有檢測(cè)到烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿，圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 陰性供試品MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of negative samples

2.7 精密度試驗(yàn)取含烏頭堿質(zhì)量濃度為22.80 ng/mL，次烏頭堿質(zhì)量濃度為26.56 ng/mL和新烏頭堿質(zhì)量濃度為19.90 ng/mL的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄定量離子的峰面積，烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的RSD分別為1.8%、2.3%和2.2%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)取本品(批號(hào):211233)共6份，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算質(zhì)量濃度和RSD值，烏頭堿的質(zhì)量濃度為0.095 ng/mL，RSD為3.6%;次烏頭堿的質(zhì)量濃度為1.064 ng/mL，RSD為2.1%和新烏頭堿的質(zhì)量濃度為0.090 ng/mL，RSD為3.0%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下樣品，分別于0、3、6、10、15、24 h進(jìn)樣分析，記錄定量離子峰面積，烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的RSD分別為2.3%、1.3%和1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收試驗(yàn)分別精密量取含烏頭堿對(duì)照品質(zhì)量濃度為114 ng/mL溶液0.05 mL，含次烏頭堿132.8 ng/mL溶液0.5 mL，含新烏頭堿99.5 ng/mL溶液0.05 mL，置100 mL平底燒瓶，用氮?dú)獯抵两?，再精密量取供試品溶?0 mL(批號(hào):211233)，按照2.3項(xiàng)下制備成供試品溶液，進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，結(jié)果表明方法回收率好，準(zhǔn)確度高，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3種烏頭類(lèi)生物堿加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for the three kinds of aconitine alkaloids

2.11 樣品測(cè)定精密量取本品50 mL，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)和2.2項(xiàng)下的色譜條件和質(zhì)譜條件測(cè)定供試品溶液，以外標(biāo)法定量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品的測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Contents of the three kinds of aconitine alkaloids in the samples(n=3)

3 討論

3.1 測(cè)定方法的選擇曾經(jīng)摸索用普通的液相色譜來(lái)測(cè)定，由于正骨水是經(jīng)過(guò)蒸餾提取而制成的，并且不同產(chǎn)地和炮制方法的草烏藥材，其生物堿的含有量不一樣，在廠(chǎng)家提供的樣品中含3種烏頭堿的含有量都比較低，達(dá)不到液相的檢出濃度，由于LC-MS/MS具有靈敏度高，選擇性好，能夠很好的測(cè)定正骨水中的3種烏頭堿的含有量。

3.2 樣品的提取方法的選擇由于正骨水是由26味藥材提取而得，成分非常多，而且基質(zhì)復(fù)雜，也曾經(jīng)嘗試用直接進(jìn)樣來(lái)測(cè)定烏頭類(lèi)生物堿，結(jié)果基質(zhì)效應(yīng)太嚴(yán)重，無(wú)法測(cè)定;并且正骨水中含有水，用普通的水浴很難蒸干，改用水浴減壓蒸干，最后也還有大概15 mL黏稠的液體，用氨水使成堿性環(huán)境，使成單體成分存在，再用乙醚提取，在提取過(guò)程中很容易乳化，改用離心能夠達(dá)到很好的分層。

3.3 檢出限的測(cè)定由于用LC-MS/MS測(cè)定，儀器靈敏度都非常高，最后測(cè)定出3種烏頭堿的檢出限均為0.01 ng/mL。

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