農吉利有效成分的HPLC指紋圖譜研究

張薇，樊輕亞，范華均，黃曉文，佘旭輝，劉小琴

(1.廣東藥學院基礎學院，廣東廣州510006;2.廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006;3.信陽職業技術學院藥學與檢驗系，河南信陽464000)

農吉利系豆科豬屎豆屬植物野百合Crotalaria sessiliflora L.的干燥全草，也稱鼠蛋草、響鈴草、芝麻響鈴鈴、細葉芝麻鈴，其味淡、性平，有解毒、抗癌的功能，主要含有生物堿和黃酮類化合物。近年來有關農吉利及其有效成分的研究逐漸增多［1-3］。農吉利主要分布于亞洲東南部和日本等地，各地藥材的質量及其差異的相關研究還未曾見有報道。本實驗考慮到農吉利中黃酮和生物堿兩類化合物在有效成分的含有量、性質及色譜分離行為上存在較大差異，通過樣品前處理，采用液相色譜-電噴霧-串聯質譜(LC-ESI-MS/MS)法鑒定其主要成分，以牡荊素和農吉利甲素分別作為參照峰，利用高效液相色譜(HPLC)法建立了黃酮和生物堿兩類化合物有效成分的HPLC指紋圖譜。考察了10批農吉利藥材，同時定量測定了牡荊素、農吉利甲素，為該藥材的鑒別以及其質量評價提供依據。

1 儀器和材料

1.1 主要儀器與試劑LC—10液相色譜儀(帶LC-Solution色譜工作站，日本島津公司);Aglient 1100 HPLC—MS Trap XCT(美國Agilent公司);Acquity UPLC—Q—Tof Micro聯用儀(美國Waters公司);PJ21C-AN微波爐(美的公司);HH—6恒溫水浴鍋(江蘇金壇宏華儀器廠);RE52CS—1旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);pHS—25數顯pH計(上海精密科學儀器有限公司)。

牡荊素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111687-200701);異牡荊素對照品(上海永恒生物科技公司，批號:38953-85-4);農吉利甲素對照品(美國New Jersey公司，批號:315-22-0);甲醇，乙腈(色譜純，Merk公司);除注明外其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

指紋圖譜分析軟件為國家藥典委員會的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)。

1.2 試藥從市場購買不同產地的農吉利樣品共10份，藥材樣品來源見表1，經本校中藥學院劉基柱副教授鑒定均為豆科植物野百合的干燥帶葉莖枝。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備準確稱取牡荊素、異牡荊素和農吉利甲素對照品各5.0 mg，用甲醇溶解后定容至1 0 mL，分別配制成質量濃度為0.50 mg/mL貯備液，保存于冰箱。使用時按需要逐級稀釋。

表1 農吉利藥材來源Tab.1 Samples of Crotalaria sessiliflora L.

2.1.2 供試品溶液的制備［4-6］稱取80目的藥材粉末5.0 g于燒瓶中，加入150 mL甲醇，置于微波爐中，調節微波功率780 W，分別加熱回流50 min和100 min后，旋干，得到浸膏。平行制備兩份。

黃酮化合物供試品溶液的制備一份加入60 mL水溶解，再將其通過AB-8大孔吸附樹脂柱，用水洗滌后，吸附的黃酮化合物再用90%乙醇(V/V)洗脫，旋干洗脫液，用甲醇溶解，定容至10 mL。

生物堿供試品溶液的制備另一份加入0.1 mol/L HCl溶液50 mL溶解，轉移至分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷萃取，棄去下層，重復3次;再滴加氨水，調節上層溶液酸度至pH 10～11，然后用20 mL三氯甲烷萃取3次，合并三氯甲烷層，旋干溶劑后用甲醇溶解，并定容至5 mL。

2.2 色譜分析

2.2.1 HPLC分析條件黃酮化合物和生物堿的供試品溶液分別以甲醇(A)-0.5%冰乙酸溶液(B)和甲醇(C)-0.04%氨水溶液(D)為流動相，采用梯度洗脫程序分離(見表2);UltimateTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);DAD檢測器;柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;進樣量10 μL。

表2 HPLC梯度洗脫程序Tab.2 Procedures of gradient elution for flavonoids and alkaloids by HPLC

2.2.2 LC-MS分析條件

2.2.2.1 黃酮化合物的分析條件紫外檢測器，檢測波長330 nm;其他條件同2.2項下黃酮化合物的色譜分離條件。

電噴霧離子阱多級質譜儀ESI離子源;正離子和負離子檢出模式;離子源溫度110℃;質量掃描范圍50～600 m/z;干燥氣(N2)體積流量600 L/h;干燥氣溫度350℃;毛細管電壓3.5 kV;霧化氣壓力50 psi(1 psi=6.895 kPa)。

2.2.2.2 生物堿的分析條件Aquity UPLC BHE C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm);流動相為乙腈(E)－0.5%乙酸胺水溶液(F)，采用梯度洗脫程序(0～3 min，5%E;3～15 min，5%～30%E;15～17 min，30%～50%E;17～20 min，50%E;20～21 min，50%～95%E);紫外檢測波長216 nm;柱溫30℃;體積流量0.3 mL/min;進樣量5 μL。

電噴霧Q-TOF質譜儀ESI離子源;正離子檢出模式;離子源溫度100℃;質量掃描范圍10～600 m/z;氣化室溫度350℃;霧化氣(N2)體積流量60 L/h;脫溶劑氣(N2)體積流量600 L/h;毛細管電壓3.5 kV;錐孔電壓15 eV。

2.3 方法學的考察

2.3.1 精密度、重復性、穩定性考察根據多批藥材的色譜圖譜的初步分析結果，取如圖1、圖2所示的9種黃酮化合物和4種生物堿組分作為共有峰，通過取同一批藥材按實驗方法制備供試品溶液，用HPLC測定，考察了方法的精密度、重復性(取6份藥材)和穩定性試驗(分別在0、4、8、12、24和48 h測定)。

圖1 農吉利藥材黃酮化合物色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of flavonoids in Crotalaria sessiliflora L.

圖2 農吉利藥材生物堿的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of alkaloids in Crotalaria sessiliflora L

黃酮化合物9種組分的色譜峰峰面積的精密度、重復性、穩定性的RSD分別為0.20%～1.7%，0.11%～1.19%，0.23%～1.4%，保留時間的RSD在0.53%～1.1%之間;4種生物堿組分的色譜峰峰面積精密度、重復性、穩定性的RSD分別為0.19%～2.2%，0.39%～2.4%，0.22%～2.8%，保留時間的RSD在0.47%～2.1%之間。結果表明農吉利的黃酮化合物和生物堿組分的保留時間穩定，方法的精密度、重復性和穩定性良好，符合指紋圖譜中相對標準偏差不得大于3%的規定，因此選定這9個黃酮化合物和4個生物堿組分作為指紋圖譜的共有峰。

2.3.2 共有峰的LC-MS鑒別分別取農吉利的黃酮化合物和生物堿的供試品溶液，按照HPLC-MS條件，對色譜圖1和圖2中的各組分分別采用LCIonTrap-MS和LC-Q-TOF-MS進行了分析，其結果見表3和表4。

根據表3和表4所示的一級質譜和二級質譜信息，黃酮化合物中的峰3和峰4(圖1)及生物堿峰1(圖2)經與對照品對比，保留時間、紫外光譜、質譜數據均一致，確定為牡荊素、異牡荊素和農吉利甲素(由于農吉利生物堿的穩定性，實驗采用Q-TOF-MS更容易獲得更精確的分子量信息，有利于結構的鑒別)，其他色譜峰通過分析UV光譜、MS及MS/MS譜圖數據，并參考相關的文獻報道結果［7-14］，初步推導了4個黃酮化合物和2個生物堿可能的化學結構。

2.3.3 指紋圖譜的建立取10個批次的農吉利藥材，分別按2.1.2項制備黃酮化合物和生物堿的供試品溶液，并用HPLC依次測定，分別記錄黃酮化合物和生物堿90 min和40 min的色譜圖，在10批樣品中選擇了穩定的9個黃酮化合物和4個生物堿組分作為共有峰，非共有峰占總峰面積均小于10%。鑒于牡荊素和農吉利甲素為農吉利的主要有效成分，且含有量較高、穩定，其色譜峰所占比例大，故分別將其作為黃酮化合物和生物堿圖譜的參照峰。采用國家藥典委員會開發的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統研究版(2004A)處理，設定S1樣品為參照圖譜，將其它樣品的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，獲得農吉利藥材指紋圖譜共有模式，以及10個批次農吉利藥材的指紋圖譜和相對峰面積，結果分別見表5、圖3。

表3 農吉利中黃酮化合物的LC-MS分析結果Tab.3 Obtained data of flavonoids in Crotalaria sessiliflora L.by LC-MS

表4 農吉利中生物堿化合物的LC-MS分析結果Tab.4 Obtained data of alkaloids in Crotalaria sessiliflora L.by LC-MS

表5 10批藥材中黃酮與生物堿化合物共有峰面積及相似度分析結果Tab.5 Relative peak area of common characteristic peaks and similarity analysis for flavonoids and alkaloids in ten batches of samples

圖3 農吉利藥材中黃酮化合物(A)和生物堿(B)的指紋色譜圖Fig.3 HPLC fingerprints of flavonoids(A)and alkaloids(B)in Crotalaria sessiliflora L.

通過計算得出農吉利樣品指紋圖譜的共有模式，并依此為標準進行比較，各產地的10批農吉利藥材相似度均大于0.90，黃酮和生物堿類組分相似度計算結果分別在0.975～0.995和0.908～0.990之間，符合國家藥品監督管理局對中藥指紋圖譜相似度的要求;但不同產地的藥材各個組分的色譜峰之間的相對峰面積并不相同，表明藥材之間各組分含有量有明顯差異，以牡荊素和農吉利甲素含有量最高，作為藥材的主要特征有效成分對于藥效學、質量標準研究及其開發利用具有重要意義。

2.3.4 主要有效成分測定按照實驗方法制備黃酮化合物和生物堿供試品溶液，在文獻［5，7］基礎上分別測定了10批藥材農吉利中主要有效成分牡荊素和農吉利甲素，結果見表6。

表6 不同產地農吉利中牡荊素和農吉利甲素的測定結果±s，n=3)Tab.6 Results of determination of vitexin and monocrotaline in ten batches of samples±s，n=3)

表6 不同產地農吉利中牡荊素和農吉利甲素的測定結果±s，n=3)Tab.6 Results of determination of vitexin and monocrotaline in ten batches of samples±s，n=3)

樣品RSD/%S10.2681.20.0751.3 S20.2521.70.0691.8 S30.2462.00.0821.7 S40.4281.00.0271.5 S50.4011.80.0122.1 S60.4122.10.0171.6 S70.2541.80.0531.8 S80.1981.00.0471.7 S90.2351.40.0321.7牡荊素質量分數/(mg·g－1)RSD/%農吉利甲素質量分數/(mg·g－1)S100.2212.00.0311.3

由表6可知，牡荊素和農吉利甲素的質量分數分別在0.221～0.428 mg/g和0.012～0.082 mg/g之間，表明各個產地和批次的農吉利藥材含有的牡荊素和農吉利甲素的量有較大差異，其RSD在1.0%～2.1%之間，均小于3.0%，質量穩定，方法的重復性好，精密度高。

3 討論

3.1 通過實驗條件優化，比較了溶劑回流提取、超聲提取和微波輻射溶劑回流提取3種方法對藥材的提取效果，結果表明，3種方法均含有共同兩類有效成分的色譜峰，但微波輻射溶劑回流提取方法的提取效率更高。

3.2 采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液、甲醇-乙酸以及甲醇-三乙胺溶液、甲醇-氨水溶液等體系作為流動相分別考察了對黃酮化合物、生物堿成分色譜分離的影響。結果表明:采用甲醇-0.5%乙酸水溶液，在85 min內可完全分離出黃酮提取液中的11個組分，用DAD檢測出9種組分在250～280 nm以及300～350 nm之間有兩個較強的特征吸收帶，與黃酮化合物的紫外特征吸收吻合;采用甲醇－0.04%氨水溶液梯度洗脫，在35 min內可較好地洗脫分離出生物堿提取液中的6個組分，用DAD檢測其紫外光譜發現4個組分分別在200～215 nm和215～270 nm有兩個吸收譜帶，與文獻報道的吡咯里西啶生物堿紫外吸收光譜吻合［16］。

3.3 通過對10批不同產地的農吉利藥材提取液色譜圖的研究，利用HPLC-ESI-MS/MS鑒定和推斷了幾種黃酮化合物和生物堿成分，以含有量較高的牡荊素和農吉利甲素分別作為黃酮化合物和生物堿指紋圖譜的特征參照峰，建立了農吉利中黃酮化合物和生物堿的HPLC指紋圖譜分析方法。分別用通過樣品前處理后的黃酮化合物和生物堿色譜圖建立指紋圖譜，各組分分離更簡單、純度更高、指紋圖譜的特征性更強，方法的精密度、穩定性、重復性更好，10個產地樣品的農吉利黃酮和生物堿的相似度均在0.9以上，符合國家對中藥指紋圖譜的技術要求。

3.4 通過對不同產地藥材指紋圖譜的研究和牡荊素和農吉利甲素等組分的峰面積比較，可以發現不同產地的藥材基本特征相似，質量穩定，但各個組分的色譜峰面積及含有量不盡相同，尤其是牡荊素和農吉利甲素主要成分的含有量相差較大(分別最大相差近2倍和8倍)，如要進一步研究有效成分，控制藥材質量和篩選藥材，應固定產地及加工方法，以減少因此而導致藥材成分的變化。

［1］Prabhakar M C，Bano H，Kumar I，et al.Pharmacological investigations on vitexin［J］.Planta Med，1981，43(13):396-403.

［2］Yoo H S，Lee J S，Kim C Y，et al.Flavonoids of Crotalaria sessiliflora［J］.Arch Pharm Res，2004，27(5):544-546.

［3］Mun'im A，Negishi O，Ozawa T.Antioxidative compounds from Crotalaria sessiflora［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2003，67(2):410-414.

［4］樊輕亞，范華均，黃曉文，等.微波輻射/HPLC測定農吉利中牡荊素和異牡荊素的含量［J］.中成藥，2010，32(2):326-329.

［5］黃曉文，樊輕亞，佘旭輝，等.微波輻射溶劑提取-分光光度法測定農吉利中的總黃酮［J］.化學分析計量，2010，19(6):4-6.

［6］張煜帆，樊輕亞，黃曉文，等.微波輻射-溶劑回流提取農吉利中農吉利甲素［J］.中國現代應用藥學，2009，26(10):819-823.

［7］March R E，Lewrs E G，Stadey C J，et al.A comparison of flavonoid glycosides by electrospray tandem mass spectrometry［J］.Int J Mass Spectrom，2006，248(1/2):61-85.

［8］Geoffrey C K，Elaine A P，Fiona C D，et al.Data-directed scan sequence for the general assignment of C-glycosylflavone O-glycosides in plant extracts by liquid chromatography-ion trap mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2006，1104(1/2):123-131.

［9］中國科學院上海藥物研究所植物化學研究室.黃酮體化合物鑒定手冊［M］.北京:科學出版社，1981:455.

［10］叢浦珠.質譜學在天然有機化學中的應用［M］.北京:科學出版社，1987:421，428.

［11］Kaleab A，Frank S，Michael W.Patterns of pyrrolizidine alkaloids in 12 Ethiopian Crotalaria species［J］.Biochem Syst Ecol，2004，32(10):915-930.

［12］Zhou Y，Li N，Choi F F，et al.A new approach for simultaneous screening and quantification of toxic pyrrolizidine alkaloids in some potential pyrrolizidine alkaloid-containing plants by using ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2010，681(1/2):33-40.

［13］Liu F，Wan S Y，Jiang Z J，et al.Determination of pyrrolizidine alkaloids in comfrey by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry［J］.Talanta，2009，80(2):916-923

［14］趙家俊，方一葦.雙吡咯烷類生物堿的特定質譜裂分方向及其特征離子系列的研究［J］.分析化學，1981，9(4):418-423.

［15］方一葦，卞則梁，王光輝，等.雙吡咯烷類生物堿的質譜斷鍵機理研究［J］.化學學報，1981，39(2):139-146.

［16］Betz J M，Eppley R M，Taylor W C，et al.Determination of pyrrolizidine alkaloids in commercial comfrey products(Symphytum sp.)［J］.Pharm Sci，1994，83(5):649.