川牛膝不同變種的品質評價

譚玉柱，陳寶華，李敏，謝運飛，趙高瓊，董小萍(成都中醫藥大學藥學院，四川成都611137)

川牛膝為莧科Amaranthaceae植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根。具有逐瘀通經，通利關節，利尿通淋等功效［1］。生用以逐瘀通經為主，酒炙后增強逐瘀、通利關節，鹽炙則增強利尿通淋［2］。植物甾酮類成分如蛻皮甾酮、牛膝甾酮、紅莧甾酮等多羥基甾體化合物是牛膝中的主要有效組分［3］。2010年版《中國藥典》以杯莧甾酮(C29H44O8)為指標性成分，對其進行測定，規定按干燥品計算其含有量不得少于0.030%［1］。川牛膝為著名的川產地道藥材之一，既是常用中藥材，又是重要的出口品種。川牛膝主產于四川、云南、貴州，其中產量最大產區以四川雅安的寶興、天全、漢源縣和樂山金口河區為主［4］。而在這些產區中，受不同生長環境和氣候的影響，川牛膝又有紅牛膝、白牛膝以及雜交牛膝3個變種。在重視祖國醫藥發展和西部大開發的今天，開發利用川牛膝也就顯得尤為重要?，F代對川牛膝已經有了較為全面深入的研究，但針對川牛膝不同變種品質評價的研究鮮有報道。本實驗立足薄層色譜鑒別、特征指紋化學對比以及杯莧甾酮測定三方面，對其品質進行初步評價，為合理、科學地開發利用川牛膝資源提供依據。

1 實驗材料與儀器

1.1 藥材來源實驗用川牛膝不同品種分別采自四川省雅安市，共計10批藥材，經成都中醫藥大學生藥學李敏教授鑒定為紅牛膝［即麻牛膝(頭序杯莧)Cyathula capitata(Wall.)Moq］、白牛膝(即川牛膝Cyathula officinalis Kuan)及雜交牛膝。藥材來源見表1。

表1 川牛膝不同品種藥材來源Tab.1 Sources of the different Cyathula officinalis Kuan

1.2 實驗器材硅膠G板10 cm×20 cm(自制);杯莧甾酮(cyasterone)(成都普思生物科技有限公司，純度98%);Agilent 1200Series高效液相色譜儀，Agilent 1200 Series DAD檢測器，甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備取本品粉末2 g，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至約1 mL。加于中性氧化鋁柱(100～200目，2 g，內徑為1 cm)上，用甲醇-乙酸乙酯(1∶1)40 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 杯莧甾酮對照品溶液配制取杯莧甾酮對照品加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 薄層色譜實驗條件照薄層色譜法(2010年版《中國藥典》附錄ⅥB)試驗，分別吸取供試品溶液5～10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，分別以A系統三氯甲烷-甲醇(10∶1)、B系統三氯甲烷-丙酮-甲酸(6∶2∶1)、C系統乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(1∶1∶0.5∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視，比較3種不同變種川牛膝顯色現象。

2.1.4 結果在不同展開體系下，不同變種川牛膝展開現象有顯著差別。如圖1所示，圖中川牛膝品種依次為:1.紅牛膝2.白牛膝3.雜交牛膝。

圖1 不同川牛膝TLC圖Fig.1 TLC chromatograms of Cyathula officinalis Kuan

2.2 特征指紋圖譜對照

2.2.1 供試品的制備取本品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，搖勻，濾過，回收溶劑，殘渣用甲醇定容至5 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 色譜條件DiamonsilC-18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為0.1%磷酸水，流動相B為乙腈，柱溫30℃，體積流量0.8 mL/min，λ=210 nm。

2.2.3 不同變種川牛膝化學成分比較參照川牛膝標準指紋圖譜研究結果［5］，鏡像定性比較3種川牛膝化學成分差異(見圖2)，由上至下依次為紅牛膝-白牛膝、紅牛膝-雜交牛膝、白牛膝-雜交牛膝。

2.3 杯莧甾酮測定

2.3.1 色譜條件DiamonsilC-18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為A(甲醇)-B(水)，按表2進行梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min;柱溫為30℃;檢測波長243 nm。理論板數按杯莧甾酮峰計算應不低于3 000。

2.3.2 方法與結果

2.3.2.1 供試品溶液制備取本品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，搖勻，濾過，回收溶劑，殘渣用甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

圖2 不同川牛膝鏡像圖Fig.2 Mirror symmetry of the different Cyathula officinalis Kuan

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program

2.3.2.2 對照品溶液制備取杯莧甾酮對照品適量，精密稱定。加甲醇制成每1 mL含50 μg的對照品溶液。依選定的色譜條件進樣測定。

2.3.2.3 線性關系考察取杯莧甾酮對照品適量，精密稱定。加甲醇制成每1 mL含50 μg的對照溶液。依選定的色譜條件進樣測定，以峰面積(Y)和進樣體積(X)進行線性回歸，回歸方程為Y=52.765X+160.5，r=0.999 6，線性范圍為0.204 4～1.022 μg。

2.3.2.4 精密度實驗取川牛膝對照品溶液，連續進樣5次，記錄峰面積并計算RSD。結果杯莧甾酮的峰面積RSD為1.03%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.5 穩定性試驗取對照品溶液在0、4、8、12、24 h，分別進樣10 μL，記錄杯莧甾酮峰面積。結果其峰面積RSD為2.37%，表明對照品在溶液中24 h內穩定。

2.3.2.6 重復性考察精密稱取6份同一品種川牛膝藥材粉末0.2 g，制備供試品溶液，進樣測定杯莧甾酮的峰面積，計算。結果同一品種的川牛膝杯莧甾酮RSD為1.09%。

2.3.2.7 加樣回收率試驗精密取已知杯莧甾酮含有量的川牛膝樣品約2 g，共6份，分別加入等量的杯莧甾酮對照品，按供試品溶液制備項下方法進行處理，結果杯莧甾酮的平均回收率為101.9%;RSD為1.22%。

2.3.2.8 樣品測定分別精密稱取不同品種川牛膝藥材粉末各3份，每份各約1 g，按照供試品溶液制備項下處理。對照品與供試品分別進樣10 μL，外標法測定不同變種川牛膝藥材中杯莧甾酮，計算均值，結果見表3，圖3。

表3 杯莧甾酮測定結果(n=3)Tab.3 Determination of cyasterone(n=3)

圖3 對照品與樣品HPLC圖Fig.3 Chromatogram of reference substance and sample

3 結論

3.1 成分差異比較TLC圖顯示，A系統是參照2010年版《中國藥典》，結果顯示紅牛膝、白牛膝及雜交牛膝在原點處差異顯著，即后兩者均有黑色未展開斑點。B系統展開，結果顯示主要差異體現在Rf=0.23和Rf=0.58的粉紅斑點及黑色未展開斑點。C系統展開，黑色斑點尤為明顯，而在紅牛膝中未見此黑色斑點。

川牛膝化學成分對照顯示，不同品種牛膝化學成分差異較大。鏡像圖譜直觀顯示三者成分差異，即:紅牛膝與白牛膝成分差異主要體現在1、2、3、4區，紅牛膝與雜交牛膝成分差異主要體現在1、2、3區，白牛膝與雜交牛膝成分差異主要體現在1、2區。初步判定，三者差異成分主要體現在極性較大區段，這與TLC結果一致。

3.2 指標性成分比較高效液相色譜測定不同變種川牛膝中指標性成分杯莧甾酮，結果各川牛膝中杯莧甾酮含有量為白牛膝＞雜交牛膝＞紅牛膝。

4 討論

4.1 本研究中紅牛膝、白牛膝、雜交牛膝系道地藥材川牛膝不同變種，白牛膝與紅牛膝學名已有確定，而雜交牛膝學名目前還未明確命名。在川牛膝TLC研究中探索了石油醚-丙酮、石油醚-乙酸乙酯、三氯甲烷-丙酮、三氯甲烷-丙酮-甲酸、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水等展開體系，最終確定本實驗TLC展開條件。在顯色觀察中，作者分別紫外觀察、碘顯色、噴硫酸乙醇，結果顯示噴硫酸乙醇顯色效果明顯，差異顯著，并最終確定顯色條件。

4.2 化學成分表征結果顯示，不同變種川牛膝中白牛膝及雜交牛膝較紅牛膝化學成分復雜，主要差異集中體現在極性較大部位，而對于差異成分的分離鑒定有待進一步研究;指標性成分杯莧甾酮的比較顯示，白牛膝＞雜交牛膝＞紅牛膝。中藥材存在多來源、多品種情況，僅以指標性成分的定性檢測與定量測定評價藥材質量優劣缺乏科學依據，應以生物評價為核心，感官評價和化學評價并重，同時建立基于“功效-毒性-物質”的中藥質量控制與評價的新型方法體系［6］，構建面向臨床的中藥標準化［7］?；谥兴幩幚碜饔玫亩喑煞?、多靶點角度評價川牛膝品質，本研究認為白牛膝及雜交牛膝品質優于紅牛膝，這也與當地習用經驗吻合。當然，建立完善的中藥材質量評價體系還應進行重金屬、農殘限度檢查，從根本上規范藥材質量標準，保證用藥安全、有效、可控。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:36.

［2］黎萬壽，陳幸，李彬.正交法優選鹽炙川牛膝最佳炮制工藝［J］.時珍國醫國藥，2005，16(12):18-19.

［3］鄭義哲，劉本.牛膝中植物甾酮類成分的研究進展［J］.科技通報，2008，24(6):820.

［4］葉品良，彭娟，劉娟.川牛膝研究概況［J］.中醫藥學報，2007，35(2):52.

［5］譚玉柱，童婷婷，潘曉麗，等.川牛膝指紋圖譜研究［J］.成都中醫藥大學學報，2011，34(3):75-77.

［6］趙軍寧，鄢良春，宋軍，等.基于“功效-毒性-物質”的新型中藥質量控制模式的思路與方法［C］//第三屆中醫藥現代化國際科技大會學術委員會，中醫藥創新與發展，成都:四川科學技術出版社，2010.

［7］肖小河，王伽伯，鄢丹，等.面向臨床的中藥標準化研究概況［C］//第三屆中醫藥現代化國際科技大會學術委員會，中醫藥創新與發展，成都:四川科學技術出版社，2010.