藏藥三味檀香湯散對全腦缺血/再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經元DND和凋亡的影響

劉杰，劉輝琦，王生蘭，曹學鋒，吳穹

(青海大學醫(yī)學院，青海西寧810001)

三味檀香湯散藏藥名:贊旦松湯，由檀香100 g、肉豆蔻100 g、廣棗100 g經過粉碎、混合制成的棕紅色散劑，方中檀香為君藥，輔以肉豆蔻和廣棗，具有清熱、祛風、養(yǎng)心之功效，是蒙藏醫(yī)治療心熱病的常用藥方［1］。目前應用三味檀香湯散在心血管缺血缺氧方面有一些研究［2-7］，認為此方劑對急性缺血缺氧、心肌缺血/再灌注損傷引起的心肌細胞損傷具有一定的保護作用［4］，但對腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，I/R)研究的報道甚少。本實驗通過四血管閉塞法復制大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型，全腦缺血/再灌注損傷前藏藥低、高劑量組分別用三味檀香湯散低、高劑量給大鼠灌胃預處理，標本硫堇染色下觀察海馬CAl區(qū)神經元組織學分級(Histological grade，HG)、神經元密度(neuronal density，ND)的變化，反映神經元遲發(fā)性死亡(Delayed Neuron Death DND)的情況;采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)檢測神經細胞凋亡陽性個數(shù)和免疫組織化學法檢測caspase-3表達的變化，反映神經元凋亡的程度，為探討三味檀香湯散對全腦缺血/再灌注損傷大鼠海馬CAl區(qū)神經元的保護作用提供實驗依據(jù)。現(xiàn)將有關情況報告如下。

1 材料

1.1 動物蘭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供雄性Wistar大鼠［SCXK(甘)2009-0004］，清潔級，48只，在我院實驗室飼養(yǎng)2～3周，體質量至280～320 g開始實驗。

1.2 藥物與試劑藏藥三味檀香湯散(青海省金訶藏藥廠生產，標準編號:WS3-BC-0260-95)，每袋裝40 g，用前研磨成粉，用蒸餾水配制成50%的水溶液(每毫升溶液含生藥0.5 g)［4］;硫堇(分析純)購于美國Sigma公司，TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒購于北京中昊時代生物公司，caspase-3免疫組化染色試劑盒購于武漢博士德生物工程公司。

2 方法

2.1 大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型的制備采用Pulsinelli四血管閉塞法建立全腦缺血模型。所有實驗動物首先凝閉雙側椎動脈，方法如下:動物全麻、固定，后頸部縱行切口，鈍性分離暴露雙側翼狀孔，徹底電凝雙側椎動脈，術畢單籠飼養(yǎng)48 h后復制動物全腦缺血/再灌注損傷模型:乙醚吸入麻醉、夾閉雙側頸總動脈持續(xù)8 min，首先可見大鼠瀕死掙扎，后翻正反射消失，雙瞳孔散大、對光反射消失，部分動物出現(xiàn)呼吸暫停，缺血8 min后迅速解除頸總動脈夾閉，大鼠雙眼瞳孔逐漸恢復至正常，對光反射、翻正反射恢復，完成腦缺血/再灌注損傷模型復制，術畢將動物單籠獨飼養(yǎng)(按標記檢測HG、ND的大鼠飼養(yǎng)7 d，檢測TUNEL和caspase-3的大鼠飼養(yǎng)3 d)。

2.2 動物分組與給藥方法48只大鼠隨機分為4組(每組12只:6只用于硫堇染色觀察HG和ND，6只用于檢測TUNEL和caspase-3陽性細胞數(shù)):①假手術組:凝閉雙側椎動脈，暴露但不夾閉雙側頸總動脈;②全腦缺血/再灌注損傷模型組:凝閉雙側椎動脈，夾閉雙側頸總動脈8 min;③三味檀香湯散低劑量預處理組(藏藥低劑量組):在全腦缺血前10 d起三味檀香湯散按成人劑量的10倍，即1.0 g/kg，每天灌胃1次，連續(xù)10 d，余同I/R模型組;④三味檀香湯散高劑量預處理組(藏藥高劑量組):藏藥按成人劑量的15倍，即1.5 g/kg給藥，余同藏藥低劑量組。

2.3 指標測定及方法按動物分組標記造模規(guī)定時間斷頭處死動物，冰皿上快速取腦，在自嗅結節(jié)前緣4 mm處做成厚約4 mm包含雙側海馬組織的冠狀切面的腦片，放入4%多聚甲醛液中固定48 h，脫水，浸蠟，包埋后連續(xù)5 μm切片。①硫堇染色，按Kitagawa和Kato方法，于光學顯微鏡下，確定HG:0級，無神經元死亡;1級，散在神經元死亡;2級，成片神經元死亡;3級，幾乎全部的神經元死亡。取雙側平均等級作為統(tǒng)計值;ND:計數(shù)海馬CAl區(qū)每1 mm2區(qū)段內細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目，每張切片雙側海馬各計數(shù)3個區(qū)段取平均值作為統(tǒng)計值，根據(jù)海馬CAl區(qū)HG和ND結果，反映DND的程度，對其組織學改變進行評價。②采用TUNEL法原位標記DNA片段檢測凋亡細胞，具體步驟參照產品說明書。③采用免疫組織化學染色(鏈酶菌抗生物素蛋白過氧化物酶法)檢測caspase-3的表達。caspase-3及TUNEL陽性物質位于細胞核內，使胞核呈棕黃色，采用顯微計數(shù)法(400×)，隨機選取缺血海馬5個視野，計算每1 mm2區(qū)段內TUNEL標記和免疫組化caspase-3顯色陽性的細胞進行計數(shù)，根據(jù)兩者的變化反映海馬CAl區(qū)神經元凋亡程度。

2.4 統(tǒng)計學處理應用SPSS l1.5軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用±s表示，單因素方差分析(One-Way ANOVA)及t檢驗進行組間比較，組織學分級采用多樣本等級資料的秩和檢驗進行組間比較。以P＜0.05為差異有顯著性的判斷標準。

3 結果

觀察各組大鼠海馬CAl區(qū)神經元組織學分級(HG)的HG結果見表1，檢測各組大鼠神經元密度ND結果見表2，神經元凋亡(TUNEL)陽性細胞個數(shù)及caspase-3的比較結果見表3。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經元組織學分級(HG)結果

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經元密度ND結果(±s)

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經元密度ND結果(±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與全腦缺血/再灌注損傷模型組比較，#P＜0.05;藏藥高、低劑量組間比較，▲P＜0.05。

組別ND/(個·mm－2)183.667±6.408 3全腦缺血/再灌注損傷模型組30.333±4.885 4*藏藥低劑量組48.500±12.629 3*#藏藥高劑量組68.167±12.106 5*#▲假手術組

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL凋亡細胞和caspase-3表達的結果±s)

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL凋亡細胞和caspase-3表達的結果±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與全腦缺血/再灌注損傷模型組比較，#P＜0.05，藏藥高、低劑量組間比較，▲P＜0.05。

組別凋亡細胞數(shù)/(個·mm－2)caspase-3/(個·mm－2)10.833±2.926 920.625±6.255 0全腦缺血/再灌注損傷模型組138.167±13.044 8*79.250±8.811 5*藏藥低劑量組117.167±12.890 6*#61.625±10.528 0*#藏藥高劑量組92.333±8.140 4*#▲54.125±12.710 4*#假手術組

3.1 假手術組大鼠海馬CA1區(qū)的錐體細胞2至3層整齊排列、細胞形態(tài)正常，細胞膜、細胞核無缺損、且胞核圓，位于中央，部分細胞可見核仁，尼氏體，HG為0級，ND為183.667±6.408 3個/mm2。TUNEL及免疫組化染色淺，少見凋亡小體及核固縮，細胞核染色少見，TUNEL法計數(shù)凋亡細胞數(shù)為10.833±2.926 9個/mm2，caspase-3陽性染色細胞為20.625±6.255 0個/mm2。

3.2 全腦缺血/再灌注損傷模型組大鼠海馬CA1區(qū)見明顯的組織損傷，多數(shù)錐體細胞崩解，大量細胞碎片散布，存活的錐體細胞零星分布，部分細胞體積縮小，呈不規(guī)則形，核膜不完整、核仁不見，HG增高為3級，而ND顯著性降低。TUNEL及caspase-3免疫組化深染，凋亡細胞(138.167±13.044 8)個/mm2和caspase-3陽性細胞(79.250±8.811 5)個/mm2數(shù)目明顯增多，顯著高于其它三組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3.3 藏藥組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經元HG級別降低、ND數(shù)目升高，組織損傷程度減輕，可見存活的錐體細胞增多，TUNEL陽性凋亡細胞和caspase-3染色細胞數(shù)目減少，檢測藏藥低、高劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經元四項指標與假手術組和全腦缺血/再灌注損傷模型組的結果比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。藏藥低、高劑量組間比較，后者作用強于前者，其中ND數(shù)、TUNEL凋亡陽性細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，HG、caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

4 討論

藏藥三味檀香湯散主要有檀香酮、檀香酸、水楊酸等成分;化學結構:醇類-檀香腦、醛類-糖醛、倍半帖-檀香烯;屬性:行氣活血、養(yǎng)心、安神、消炎、抗菌、鎮(zhèn)咳、袪痰、補身、收斂。馬祁生等［3］研究發(fā)現(xiàn)三味檀香湯散可能是通過增強抗氧化酶活性、清除氧自由基、保護心肌線粒體結構，改善缺血心肌能量代謝和功能，提高心肌細胞對缺氧損傷的耐受性。寇毅英等［4］研究發(fā)現(xiàn)三味檀香散可能通過抑制心肌iNOS水平，減少NO過量產生，從而削弱了NO的細胞毒性作用。本實驗主要研究藏藥三味檀香湯散是否有減輕全腦缺血/再灌注損傷模型后海馬CA1區(qū)神經細胞死亡作用，為探討該藏藥是否有神經保護作用提供實驗依據(jù)。

國內外大量研究發(fā)現(xiàn)，全腦缺血/再灌注損傷模型的發(fā)生機制與興奮性氨基酸毒性、自由基損害、鈣超載、NO的細胞毒性、血-腦屏障損害、炎性損害等多因素綜合作用有關，全腦缺血/再灌注損傷模型引起細胞死亡有壞死和凋亡兩種形式，許多研究已證實，海馬CA1區(qū)錐體細胞會在全腦缺血/再灌注損傷模型后3～4 d出現(xiàn)、7 d左右逐漸發(fā)生完全的遲發(fā)性死亡(DND)現(xiàn)象，因此，本實驗選擇觀察全腦缺血/再灌注損傷模型后7 d海馬CA1區(qū)DND變化情況。實驗發(fā)現(xiàn)全腦缺血/再灌注損傷模型組大鼠HG為3級，DN減少，表明錐體細胞發(fā)生明顯的DND，模型復制成功。三味檀香湯散低、高劑量預處理后可見HG級別降低、ND數(shù)目升高，組織損傷程度減輕，且高劑量組效果好于低劑量組。

全腦缺血/再灌注損傷模型海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經元死亡的主要形式是凋亡［8］，絕大部分細胞凋亡依賴于caspase的存在，caspase的功能有:滅活凋亡抑制蛋白、直接解體細胞結構、分解與細胞骨架構成相關的蛋白、瓦解核結構成核碎片。細胞凋亡的主要途徑有兩條:①內源性途徑:Cyt-C從線粒體釋放到胞漿后與dATP、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)結合成復合物，激活caspase-9，caspase-9切割后激活caspase-3，caspases-3是凋亡的最終執(zhí)行蛋白，在細胞凋亡中起著最后樞紐的作用［9］;②外源性途徑:Fas膜受體系統(tǒng)激活caspase-8，caspase-8直接激活caspase-3［10］。TUNEL法是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法，是最常用的檢測組織樣品凋亡細胞的手段，但結果存在假陽性的缺點，所以本實驗分別用TUNEL原位標記法和免疫組織化學法檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡陽性個數(shù)和caspase-3表達的變化，反映全腦缺血/再灌注損傷模型后海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡程度，并可探索三味檀香湯散減輕細胞凋亡的發(fā)生機制。大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型后caspase-3陽性細胞與凋亡陽性細胞高峰時間基本一致［11］，即I/R后24～48 h達高峰、72 h后開始下降。因此，本實驗選擇全腦缺血/再灌注損傷模型后3d進行細胞核內凋亡細胞、caspase-3基因陽性表達的檢測。結果發(fā)現(xiàn)在全腦缺血/再灌注損傷模型模型組有大量TUNEL和caspase-3陽性細胞，而在藏藥預處理灌胃大鼠的切片中TUNEL和caspase-3陽性細胞數(shù)目明顯比I/R組減少。

本次實驗結果提示藏藥三味檀香湯散預防給藥可能有減輕全腦缺血/再灌注損傷模型后海馬CA1區(qū)DND、抑制caspase-3表達，進而起到神經保護作用。通過本實驗也發(fā)現(xiàn)三味檀香湯散低、高劑量組間，后者作用強于前者，尤其對ND數(shù)、TUNEL凋亡陽性細胞數(shù)影響明顯，對HG、caspase-3表達的影響差異無統(tǒng)計學意義。因此對于藏藥三味檀香湯散的腦保護作用的詳細機制以及預防和治療給藥的具體劑量、毒性反應等諸多問題還有待繼續(xù)深入研究。

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