益腎活血顆粒對大鼠前列腺增生模型影響的實驗研究

張育軍，侯俊明，雒向寧，柏魯寧，方永軍，張健康

(1.陜西中醫學院臨床醫學院外科教研室，陜西中醫學院中西醫結合外科研究所，陜西咸陽712046;2.廣州市中山大學附屬第一醫院泌尿外科，廣東廣州510080)

益腎活血顆粒由黃芪、山萸肉、懷牛膝、澤瀉、地鱉蟲、三棱等藥物組成，為陜西中醫學院泌尿外科治療前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia，BPH)的臨床經驗方，具有補腎益氣、活血化瘀、通利水道之功效。為探討其抗前列腺增生的可能機制，我們觀察了益腎活血顆粒對前列腺增生動物模型的前列腺質量、病理形態及半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶3(Caspase-3)表達的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料益腎活血顆粒由陜西中醫學院附屬醫院制劑中心制備，批號:110201;丙酸睪酮注射液，25 mg/mL，2 mL/支，上海通用藥業股份有限公司生產，批號:090501;非那雄胺片(保列治片)每片5mg，默沙東藥廠生產，批號:305416。一抗:Caspase-3兔抗鼠抗體，購自北京中山生物技術有限公司。電子天平;雙目光學顯微鏡;多媒體彩色病理圖文分析系統。

1.2 動物清潔級SD大鼠，雄性，鼠齡10～12周，體質量200～240 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，證號SYXK(陜)2008-005。

1.3 實驗方法雄性SD大鼠40只適應性喂養7 d，編號稱質量，腹腔注射0.2%的戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉，無菌手術摘除雙側睪丸，經一周恢復后隨機分為4組:模型組、益腎活血顆粒大劑量組、益腎活血顆粒小劑量組、陽性對照組。各組大鼠在每天皮下注射丙酸睪酮0.005 g/kg的同時開始灌胃給藥，益腎活血顆粒大劑量組和益腎活血顆粒小劑量組依次每天給予2.25、1.12 g/kg灌胃，陽性對照組給予非那雄胺片0.001 g/kg灌胃，模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續28 d，每周稱體質量以調節給藥用量。28 d后處死大鼠，摘取前列腺，稱取前列腺濕質量，計算前列腺指數，常規HE染色觀察，測定免疫組化［1-2］。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 前列腺指數(PI)PI=前列腺質量(mg)/大鼠體質量(g)。

1.4.2 Caspase-3測定通過免疫組化(PV二步法)檢測前列腺組織中Caspase-3蛋白的表達。標本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，脫蠟后滴加Caspase-3兔抗鼠抗體，濕盒內4℃過夜，復溫后PBS洗滌3次。再以二抗工作液覆蓋，濕盒內孵育，PBS洗片，DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察結果。caspase 3表達于上皮細胞漿中，以胞漿內出現棕黃色顆粒、胞核內無著色為陽性染色細胞。以圖像分析軟件分析測定其灰度值。

1.4.3 前列腺病理形態各組標本行常規H.E染色，光鏡下觀察組織病理學變化。

1.5 統計學方法用SPSS 13.0軟件進行統計分析，結果以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠前列腺指數PI的影響益腎活血顆粒大、小劑量組和陽性對照組均能使大鼠前列腺質量減少，前列腺指數降低。3個治療組抑制前列腺增生的效果較模型組明顯(P＜0.05)。尤以益腎活血顆粒大劑量組效果最為顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 各組對實驗大鼠前列腺指數PI的影響(±s，n=10)

表1 各組對實驗大鼠前列腺指數PI的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與陽性對照組比較，△P＜0.05。

組別給藥劑量/(g·kg－1)大鼠體質量/g前列腺質量/mgPI/(mg·g－1)318.5±24.42.41±0.307.57±0.85益腎活血顆粒組(大劑量)2.25320.0±21.51.45±0.18＊＊△4.53±0.52＊＊△益腎活血顆粒組(小劑量)1.12317.5±29.81.82±0.25*5.73±0.56*陽性對照組0.001316.3±25.51.68±0.17*5.41±0.72模型組－*

2.2 前列腺病理形態變化情況模型組鏡下可見前列腺腺體排列密集，腺上皮明顯增生，細胞為高柱狀，多數腺上皮呈乳頭狀突入腔內，間質纖維和平滑肌增多。益腎活血顆粒大劑量組腺體數量明顯減少，極少數呈乳頭狀突入腔內，上皮細胞大多呈單層柱狀，間質纖維和平滑肌少量增生。小劑量組和陽性對照組腺體數量較少，部分呈乳頭狀突入腔內，上皮細胞呈單層柱狀及高柱狀，間質纖維和平滑肌較多。

2.3 各組前列腺上皮組織caspase-3表達比較益腎活血顆粒大、小劑量組及陽性對照組caspase-3表達均明顯強于模型組。益腎活血顆粒大、小劑量組之間比較，差異有統計學意義(P＜0.01);益腎活血顆粒大劑量組caspase-3表達與陽性對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，益腎活血顆粒大劑量組caspase-3表達明顯強于陽性對照組;益腎活血顆粒小劑量組與陽性對照組比較，益腎活血顆粒小劑量組caspase-3表達接近于陽性對照組，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組前列腺上皮組織caspase-3的表達(±s)

表2 各組前列腺上皮組織caspase-3的表達(±s)

注:灰度值指前列腺上皮組織中caspase-3表達陽性細胞染色深度，灰度值與caspase-3含量成反比，灰度值越小，染色越深，caspase-3含量越高。與模型組比較，＊＊P＜0.01;與陽性對照組比較，△P＞0.05，△△P＜0.01，與小劑量組比較，▲▲P＜0.01。

只灰度值模型組組別給藥劑量/(g·kg－1)動物/－10157.28±6.36益腎活血顆粒組(大劑量)2.251089.53±5.37＊＊△△▲▲益腎活血顆粒組(小劑量)1.1210120.24±4.35＊＊△陽性對照組0.00110117.50±3.41＊＊

3 討論

良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia，BPH)是老年男性最常見的疾病之一，50歲以上的男性約有一半會出現臨床癥狀。增生的前列腺擠壓尿道，導致一系列排尿障礙癥狀，如尿頻尿急、尿流細弱、尿不盡等，嚴重影響患者的生活質量，不及時治療會導致許多嚴重并發癥(如急性尿潴留、膀胱結石、腎功能不全等)，甚至會危及患者的生命［3］。有關良性前列腺增生的發病機制，目前尚不完全明了。近幾年，細胞凋亡在良性前列腺增生發病中的作用機制逐漸受到人們的重視，認為良性前列腺增生是由于細胞凋亡減少，增殖增加，凋亡與增殖失衡所導致［4］。半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶-3(Caspase-3)是細胞凋亡的下游關鍵酶，Caspase-3在良性前列腺增生上皮表達下降，而在良性前列腺增生基質中幾乎不表達，其表達異常與良性前列腺增生發生密切相關［5-6］。研究發現，caspase家族廣泛存在于細胞中，主要以酶原形式存在，一旦caspase被激活，細胞死亡將不可避免地出現。caspase-3是caspase家族中最重要的成員，大多數觸發細胞凋亡的因素，最終都需要通過caspase-3介導的信號傳導途徑導致細胞凋亡［7-8］。因此，干預caspase-3的表達在研究良性前列腺增生的防治中具有非常重要的意義［9］。

前列腺增生癥屬中醫學癃閉、淋證等范疇，腎虛血瘀為前列腺增生癥的基本病機。中醫學認為，本病乃因年老體弱，腎氣虧虛，氣化無力，瘀血停滯，或濕熱互結，阻于膀胱，水道不通所致。治宜標本兼治，補腎益氣為治本，軟堅消瘀、清熱利濕為治標。益腎活血顆粒以補腎益氣、溫陽利水、活血化瘀、軟堅散結為原則組方，在我院臨床應用中取得了較好的療效。本實驗結果顯示，益腎活血顆粒能減小前列腺質量，降低前列腺指數。模型組大鼠前列腺指數明顯高于其他組，而益腎活血顆粒大劑量組PI明顯下降，鏡下見間質結締組織增生明顯減少，說明益腎活血顆粒具有較強抑制良性前列腺增生的作用。同時本實驗研究表明，模型組大鼠前列腺組織caspase-3表達明顯降低，而益腎活血顆粒大、小劑量組、陽性對照組中caspase-3的表達則明顯升高，益腎活血顆粒大劑量組caspase-3的表達也強于小劑量組和陽性對照組，益腎活血顆粒小劑量組caspase-3的表達強度接近陽性對照組，二者無顯著性差異。作為陽性對照藥的非那雄胺是治療良性前列腺增生的一線推薦用藥［10］，通過降低前列腺組織內雙氫睪酮(DHT)濃度，間接降低進入細胞核促使細胞增殖的信號水平，導致抑制細胞內特異性生長因子及其受體的表達，從而抑制前列腺細胞的增生［11］。近年來國外學者Bozec等［12］發現了非那雄胺可通過激活caspases-3和caspases-6而引發caspase介導的細胞凋亡途徑，增加前列腺細胞凋亡。本研究也證實了這一點，發現非那雄胺陽性對照組中caspase-3的表達強于模型組(P＜0.01)，與益腎活血顆粒小劑量組差異無統計學意義。

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