獸藥有關物質研究中的常見問題

劉艷華，楊大偉，郭桂芳，梁先明，段文龍

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

獸藥中的雜質按理化性質一般分為三類:有機雜質、無機雜質和殘留溶劑。有機雜質包括工藝中引入的雜質和降解產物，來源于生產工藝和/或貯存期間的降解，這類雜質的化學結構與活性成分的分子式類似或具淵源關系，故通常又稱之為有關物質［1］。有關物質的研究是獸藥研究的重要環節，貫穿于整個獸藥研究的始終。其是否能被全面準確地控制，直接關系到獸藥的質量與安全性，雖有相關技術指導原則參考［1－4］，但限于我國獸藥研發水平和生產的現狀，有關物質研究仍然是獸藥研發的薄弱環節，本文主要針對獸藥有關物質研究中常見的問題進行分析，以資借鑒。

1 分析方法的選擇

分析方法的選擇直接關系到有關物質測定結果的專屬性與準確性，因此，有關物質研究的首要問題是根據主藥及有關物質的理化性質、化學結構、有關物質的控制要求等確定適宜的檢查方法，有效檢出獸藥中的有關物質。

常用的檢查方法主要是薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)。TLC通常對有關物質進行定性或半定量研究，可以用于沒有紫外吸收的有關物質;HPLC可對有關物質進行定性或定量研究，適用于多種有關物質，是目前普遍采用的方法;氣相色譜法主要用于檢查揮發性有關物質。各種分析方法側重點不同，應用時采用不同原理的分析方法進行相互補充與驗證。

常見問題:(1)忽視檢查方法的比較、優選研究。目前的新獸藥注冊嚴格意義上說均為仿制藥，檢查方法應與已上市產品質量標準或者文獻報道的方法做對比研究。如采用HPLC方法進行鹽酸頭孢噻呋注射液的有關物質檢查，國外同品種獸藥采用梯度洗脫，最大雜質峰δ－2－反式肟，限量為3.0%，4－酮基頭孢噻呋、MW=537的未知物、δ－3－順式肟和其他雜質的總限度為3.5%;國內企業申報時采用等度洗脫，僅規定雜質總限量為不得大于3.0%;未對單個雜質進行定性研究。梯度洗脫確實存在基線漂移大、操作相對繁瑣的缺點，但其在較短時間內檢查雜質的極性范圍廣，并可改善峰形，提高靈敏度，比較適用于對多種極性不明的未知有關物質進行檢測，因此企業申報時在無充分研究的基礎上直接采用等度洗脫，且不進行對比研究，可能會導致有關物質的漏檢。(2)完全照搬國外同品種標準，未根據自身產品的特點進行針對性研究。如原料中有關物質的產生與合成工藝密切相關，鹽酸沃尼妙林原料中有關物質直接參照《歐洲藥典》6.0版進行檢查，未考察國內外合成工藝不同可能導致的產品有關物質不同;且不同儀器及色譜條件的波動，使雜質的校正因子產生一定范圍的誤差［5］，但企業申報時未提交自研產品雜質譜分析研究的相關資料，也未對相對響應因子進行相關驗證，無法對方法適用性進行判斷。

2 分析方法的驗證

有關物質的方法驗證重點在于專屬性和靈敏度的驗證。專屬性系指在其他成分可能存在的條件下，采用的方法能正確測定出被測有關物質的特性。檢測限是反映分析方法靈敏度的一個重要指標，要符合質量標準中對有關物質限度的要求，檢測限不得大于該有關物質的報告限度。

方法驗證時要結合獸藥的化學結構特點、制劑的處方工藝和降解途徑等進行研究，分析獸藥中潛在的有關物質，具體方法有:(1)有關物質可以獲得，如為已知的某中間體、副產物或降解產物，可在原料或制劑中加入一定量進行系統適用性研究，考察各有關物質與主峰間的分離度是否符合要求，從而驗證分析方法對有關物質的分離能力。(2)有關物質不可以獲得，需要與已驗證或獸藥典收載的方法進行對比或破壞性試驗。破壞性試驗多采用酸、堿、光、熱、氧化反應等強制降解來驗證，在試驗過程中，應注意適度破壞，一般以破壞后主成分的含量占絕大部分為宜(80% ～90%)，要達到這種破壞程度，需要在研究過程中進行摸索，先通過初步試驗了解樣品對光、熱、酸、堿和氧化等的基本穩定情況，然后再調整光照強度、酸堿濃度、破壞時間、溫度等試驗條件，常見的試驗條件為強光照射:4500 lx;高溫:較加速試驗溫度高10℃;酸水解:0.1～1 mol/L鹽酸或硫酸溶液;堿水解:0.1～1 mol/L氫氧化鈉溶液;氧化:3% ～5%過氧化氫溶液。注意并不是每種破壞條件下主藥必須降解，具體條件要結合獸藥的特點。

常見問題:(1)破壞程度不當。如非潑羅尼原料藥在酸、堿、氧化、光照、高溫等條件下進行破壞試驗，主藥含量分別為 99.08%、96.45%、99.44%、98.53%和99.43%，其新增有關物質含量小，破壞程度不足，不能很好考察檢測方法的分離能力。如果破壞性條件過于劇烈，會產生一些在生產和貯存條件下不可能生成的二級甚至三級降解產物，對色譜條件的篩選不利。(2)未進行檢測波長的選擇，這是獸藥有關物質研究中最常見的問題。優化的檢測波長應是主要有關物質的最大吸收，而不是主藥的最大吸收，同時，應使主藥和各主要有關物質的響應差異最小，多采用二極管陣列檢測器(DAD)進行波長的選擇。(3)未考察主藥和有關物質的物料平衡，即在主藥含量下降的同時，有關物質增加了相應的失去量。如托芬那酸注射液穩定性試驗中主藥含量下降約5%，但有關物質均未檢出，在其提供的破壞性試驗資料中僅考察主峰與相鄰有關物質峰的分離度，未對檢測波長選擇，未考察主峰與有關物質的物料平衡，也未考察空白輔料在破壞性試驗條件下的影響，因此造成方法的不可行。(4)未提供方法的靈敏度或僅文字敘述而無任何數據和圖譜來進行證明。有的企業雖然提供了圖譜，但縱坐標過大，導致實際看到的為一水平直線，無從判斷檢測限是否符合信噪比大于3的要求，試驗結果的可信度不高。(5)未進行系統適用性試驗。HPLC色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重復性和拖尾因子等四個指標。國外企業的內控標準大多制訂指標的限度，在有關物質不可獲得時，甚至通過破壞性試驗條件下的樣品來進行系統適用性試驗，國內企業在研究時多未進行相應規定，因此會出現色譜圖中明顯的主峰拖尾仍進行試驗，分辨不出是樣品超載，還是主峰包含有關物質峰造成的，分析方法不可信，結果不可靠。

3 定量方法的選擇

目前有關物質的檢查多采用HPLC法，定量方法有:(1)有關物質對照品法;(2)加校正因子的主成分自身對照法;(3)不加校正因子的主成分自身對照法;(4)峰面積歸一化法。方法1定量比較準確、定位方便，缺點是費用高、購買不到有關物質對照品時需要提供對照品的制備和考核材料，是有條件時首選的方法。方法2需對校正因子進行嚴格的測定，僅適用于已知有關物質的控制，定量比較準確，但定位較困難，需測定校正因子，適用于有關物質和主成分響應因子差異大(有關物質對主成分的相對響應因子在0.9～1.1范圍內時可忽略校正因子)且對照品昂貴時首選的方法。方法3的前提是假定有關物質與主成分的響應因子相同，適用于與主成分具有相同或類似發色基團的有關物質，其費用低、不需定位，但定量準確度較差，是有關物質對照品時首選的方法。方法4簡便快捷，但存在各有關物質響應因子不一定相同、有關物質量與主藥量不一定在同一線性范圍內、儀器對微量有關物質和常量主藥的積分精度及準確度不相同等因素，雖然費用低、不需定位，但定量準確性較差、影響因素多、結果重復性差，一般不提倡使用。

常見問題:(1)未提供采用峰面積歸一化法的理由。雖有文獻報道［6］隨著現代液相色譜儀性能的提高，儀器的線性范圍一般可達3個數量級以上，實際檢測時一般不會超出線性范圍，因此歸一化法和不加校正因子的主成分自身對照法所得結果往往基本一致。但獸藥企業在申報時并未考慮有關物質和主藥的含量是否在儀器的線性范圍內，并且采用面積歸一化法時，為防止主藥峰面積太大，進樣量少，有關物質峰可能較小，其峰面積測定值的相對誤差就會較大，理論上講可能造成面積歸一化法誤差偏大，因此該方法不推薦用于微量有關物質的檢查。(2)未提供定量時的積分參數，起草說明、標準中也未提供最小峰面積的閾值。《英國藥典》(2011年版)對有關物質規定有報告限度或最小峰面積閾值，《中國獸藥典》(2010年版)和《中國藥典》(2010年版)目前對此無強制要求，僅部分品種對此有規定，但實際檢測時，最小峰面積設定的大小，直接會影響到有關物質含量的測定值，其參數設定得越大，有關物質峰越不容易被積分出來，有關物質含量相對容易合格，對有關物質含量處于邊緣時，容易產生檢驗結論的分歧，因此建議企業在標準中對此進行規定，避免申報材料中出現明明有峰卻不進行積分的現象。

4 限度的制訂

有關物質限度的確定首先考慮安全性，尤其是有藥理作用或毒性的有關物質;其次考慮生產的可行性及批與批之間的正常波動;還要考慮獸藥本身的穩定性。

對于創新獸藥，可直接用分離純化的有關物質進行安全性研究，也可采用含有一定種類與數量有關物質的樣品進行一系列藥理毒理及臨床研究來驗證獸藥的安全有效性。如果在這些研究中并未明顯反映與有關物質有關的毒副作用，即使有關物質的含量超出指導原則［1］的報告限度，從安全性方面考慮，也可認為該有關物質的含量已經過了安全性的驗證。如有關物質是該藥物在動物中的主要代謝產物，則對該有關物質可不考慮其安全性，但需制訂合理的限度。

對于已有國家標準的獸藥，可以根據已有的標準制訂相應的有關物質限度。如果該標準中未規定有關物質的限度，應與已上市同品種獸藥進行全面的質量對比研究，根據質量對比研究的結果，以及穩定性考察的結果，決定是否在質量標準中對有關物質進行控制并制定相應的限度。由于工藝或處方的不同導致在研產品與已上市同品種產品的有關物質種類不同，若限度超過規定的合理限度，為了保證產品的安全性，應考慮優化產品的處方與制備工藝，將有關物質的含量降到規定的限度以內。如仍達不到要求，則應做必要的安全性研究。

常見問題:(1)藥理毒理和臨床研究用樣品中有關物質含量過低。一般而言，按照毒理研究樣品、臨床研究樣品和上市產品的順序，其中的有關物質含量應依次遞減，毒理研究用樣品中的有關物質含量應該最高［7］。在毒性試驗可接受的前提下，只要臨床使用獸藥中有關物質的含量小于毒性試驗中有關物質的含量，就可認為有關物質的安全性已經通過評價。目前企業提交資料中往往是藥理毒理研究樣品和臨床研究樣品相同，穩定性考察試驗樣品中有關物質含量較藥理毒理試驗樣品中有關物質含量低，如米爾貝肟原料藥藥理毒理所用樣品的含量均≥98%，但該原料藥在長期穩定性考察時1個批次0個月的有關物質檢測數據為2.20%，所制訂有關物質限度為3.0%，其安全性風險就得不到有效的控制。(2)對超過有關物質相應限度的樣品未按相關指導原則進行研究。如規定獸醫專用制劑中雜質鑒定限度為1.0%，那么高于此限度的雜質就應進行定性分析，確定其化學結構。但從申報資料的提交上看，目前多數企業未進行此類研究，因此企業在研發獸藥時，務必熟悉指導原則的有關規定，在研究的完整性和規范性上符合要求。

隨著對有關物質認識的深入、檢測手段的發展，對有關物質的技術要求也在不斷提高，企業應重視獸藥研發中的有關物質研究，通過系統全面的研究，在不影響獸藥療效、不發生與有關物質相關的毒副反應的前提下，將有關物質控制在一個安全、合理的范圍內，以切實保證獸藥的質量和安全。

［1］農業部公告第630號.獸用化學藥物雜質研究技術指導原則［S］.

［2］中國獸藥典委員會.獸藥雜質分析指導原則［S］.中華人民共和國獸藥典附錄二〇一〇年版.

［3］VICH GL10:Impurities in new veterinary drug substances［EB/OL］.(2008 － 01)http://www.www.vichsec.org/pdf/2000/GL10_ST7(R).pdf

［4］VICH GL11:Impurities in new veterinary medicinal products［EB/OL］.(2008 － 01)http://www.www.vichsec.org/pdf/2000/GL11_ST7(R).pdf

［5］張哲峰.HPLC法檢測有關物質中校正因子研究與使用中的幾點考慮［J/OL］.藥品技術審評論壇，2011(4).(2011－12 － 07)http://www.cde.org.cn/dzkw.do?method=largePage＆id=312552

［6］張啟明，李慧義.色譜分析中面積歸一化法測定有關物質的弊與利［J］.中國藥品標準，2005，6(4):45 －46.

［7］陳 震.有關物質的研究與新藥注冊［J］.中國醫藥工業雜志，2010，41(11):872－876.