原代培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的甘草毒性研究

孫新明，楊亞軍

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西吉安343000)

不孕不育癥是全球性復(fù)雜的醫(yī)學(xué)和社會學(xué)問題之一。隨著工業(yè)的日益發(fā)達(dá)及對環(huán)境污染控制的相對不足和臨床藥物濫用，男性因素所引發(fā)的不育不孕癥發(fā)生率越來越高而逐漸引起人們的重視［1-3］;長期以來，甘草等植物中草藥及其復(fù)方常作為中藥材食品添加物及臨床常用藥得以廣泛應(yīng)用。但近代藥理研究發(fā)現(xiàn)，不少臨床常用的中藥如甘草、補(bǔ)骨脂等可促進(jìn)雌性動物乳腺發(fā)育和子宮明顯增質(zhì)量及血清雌激素水平升高［4］，但其雌激素樣作用是否與環(huán)境雌激素一樣具有男性生殖毒性作用?特別是甘草對男性生殖系統(tǒng)的毒性作用目前尚未見細(xì)胞毒性研究。鑒于此，本研究從甘草對雄性小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)及其分泌睪酮的影響入手研究甘草對睪丸的生殖毒性，為甘草等具有雌激素樣作用中藥材的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料清潔級BABL/c雄鼠10只(購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司);市售藥用甘草采用超聲提取法和樹脂吸附技術(shù)自制成浸膏(含甘草提取物62.5 mg/mL)后用PBS溶液配制成10 mg/mL藥物濃度，過濾除菌，置冰箱冷藏備用;

1.2 主要試劑DMEM、DMEM/F12、小牛血清、苔盼藍(lán)購于GIBCO公司;膠原酶、透明質(zhì)酸酶、perooll分離液、Hepes購于SIGMA公司;胰蛋白酶購于AMRESCO公司;HE染色液、PBS、D-hanks液培養(yǎng)基均為自制試劑;其他常規(guī)普通試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 甘草對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的體外毒性實驗

1.3.1 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)取4～5周齡22～25 g的BABL/c雄鼠10只，按照邵冰玉等報道的方法［5］分離得到睪丸間質(zhì)細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度(3～5×105個/mL)接種于24孔培養(yǎng)板，在10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、飽和濕度)中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h換液。

1.3.2 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外藥物毒性實驗培養(yǎng)貼壁(記為0)后進(jìn)行以下分組實驗:一組為不給藥對照組，另一組為給藥實驗組。對實驗組先用MTT法［6］確定甘草提取物對睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外毒性的IC50值和最低毒性劑量，以細(xì)胞存活率為80%±的藥物濃度為細(xì)胞最低毒性劑量;細(xì)胞存活率%=(加藥細(xì)胞OD-本地OD/對照細(xì)胞OD－本地OD)×100%(本底OD值為酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測無細(xì)胞的完全培養(yǎng)基加MTT的光密度值);以IC50值和最低毒性劑量作為高、低兩個劑量藥物濃度，加入0.5 mL藥液于培養(yǎng)的0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。在細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的0、12、24 h、48 h對各組培養(yǎng)貼壁細(xì)胞進(jìn)行H-E染色后光鏡觀察。

1.3.3 睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中睪酮水平的測定用酶聯(lián)免疫吸附法，按照試劑盒使用說明測定1.3.2項中各試驗組在細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的0、12、24、48 h時培養(yǎng)液中睪酮水平。

2 結(jié)果

2.1 睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外毒性實驗結(jié)果

2.1.1 MTT法測定甘草提取物對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性結(jié)果

結(jié)果見表1。

表1 MTT法測定甘草提取物對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性結(jié)果

MTT法測定結(jié)果顯示，甘草提取物對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的體外毒性IC50=275 μg/mL，最低毒性劑量為10 μg/mL，即給藥組的高、低劑量質(zhì)量濃度分別為275 μg/mL和10 μg/mL。

2.1.2 甘草提取物對間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)果對分離到的睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)6 h后細(xì)胞開始發(fā)生極化，偶有貼壁。培養(yǎng)48 h后(0 h)多數(shù)細(xì)胞貼壁，對進(jìn)一步培養(yǎng)的各組細(xì)胞進(jìn)行H-E染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)，剛貼壁的細(xì)胞形態(tài)呈梭形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞間以其突起形成網(wǎng)絡(luò)狀連接，輪廓不清(見圖1)。隨著培養(yǎng)時間延長，在對照組細(xì)胞輪廓成為多角形或不規(guī)則形狀，有3～4個突起伸出，至進(jìn)一步培養(yǎng)48 h后間質(zhì)細(xì)胞呈多邊形或長梭形，貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多而變得越來越密集，但細(xì)胞界限越清晰，細(xì)胞間有空隙且排列無極性(圖2C～4C);在給藥實驗組，則隨著體外培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞的生長狀態(tài)變差，貼壁細(xì)胞形態(tài)變化與對照組相同，但與對照組形成鮮明對比的是，細(xì)胞的密度變得越來越稀疏，表明細(xì)胞生長分裂受到抑制，有些貼壁細(xì)胞發(fā)生凋亡，在給藥培養(yǎng)48 h顯得尤為明顯，這種變化在高濃度給藥實驗組比低濃度給藥實驗組更為突出(見圖2～4)。

圖1 培養(yǎng)48 h貼壁的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，H-E×200

圖2 對照組培養(yǎng)貼壁的睪丸間質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h(2C)、24 h(3C)和48 h(4C)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，H-E×200

圖3 高濃度給藥組培養(yǎng)貼壁的睪丸間質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h(2H)、24 h(3H)和48 h(4H)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，H-E×200

圖4 低濃度給藥組培養(yǎng)貼壁的睪丸間質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h(2L)、24 h(3L)和48 h(4L)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，H-E×200

2.1.3 培養(yǎng)液中睪酮水平檢測結(jié)果用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定培養(yǎng)液中睪酮水平，結(jié)果見圖5。統(tǒng)計結(jié)果顯示，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h及48 h后培養(yǎng)液中睪酮水平，在對照組、低劑量組和高劑量組間兩兩比較差異均極為顯著(P＜0.01)。

圖5 在各藥物濃度下培養(yǎng)間質(zhì)細(xì)胞時培養(yǎng)液中睪酮水平

3 討論

關(guān)于植物雌激素對雄性動物的影響有較多研究報道認(rèn)為，給雄性動物喂飼含異黃酮類雌激素的植物可促進(jìn)睪丸增重和血清睪酮含量，并促進(jìn)睪丸曲細(xì)精管明顯增大，初級精母細(xì)胞形成提前，即具有促進(jìn)雄性動物生殖系統(tǒng)發(fā)育的作用［7］，因而表現(xiàn)出與環(huán)境雌激素對雄性個體完全不一樣的作用［8］。但植物雌激素對睪丸細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響和中草藥雌激素樣作用對睪丸毒性的研究報道并不多。朱鋒榮等［9］的研究認(rèn)為，植物雌激素(染料木素)在低濃度下(0.1 μmol/L)給藥時可顯著促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，但當(dāng)植物雌激素濃度大于5 μmol/L時，卻顯著抑制間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌。有研究認(rèn)為，苦參可使精子瞬間失活的最低有效質(zhì)量濃度為0.85～3.15 g/L，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)苦參堿對精子有致死作用，而蘆薈對雄性鼠性腺、精液有一定的影響，使雌性小鼠的妊娠率降低，畸胎率升高［10］。

甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、緩急、止痛等功效。常用于脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸短、咳嗽痰多、脘脹、四肢攣急、疼痛、癰腫瘡、緩解藥物毒性等。中醫(yī)界自古有“十方九草”之說［11］。因此，甘草常作為中藥材食品添加物及臨床常用藥物得以廣泛應(yīng)用，其主要化學(xué)成分是甘草甜素、甘草次酸。中藥藥理學(xué)認(rèn)為，大劑量的甘草甜素有雌激素樣作用，而甘草次酸具有抑制雄性小鼠生殖腺產(chǎn)生睪酮的作用［12］，但其是否與其他含異黃酮類雌激素的植物對男性生殖系統(tǒng)具有類似的作用?目前未見詳細(xì)研究報道。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞也稱為Leydig細(xì)胞，是合成和分泌雄激素(睪酮)的主要場所，其分泌的雄激素可結(jié)合支持細(xì)胞分泌的雄激素結(jié)合蛋白而維持生精小管內(nèi)較高的雄激素濃度，以促進(jìn)生精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞的增殖、發(fā)育，因此睪丸間質(zhì)細(xì)胞與支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞之間關(guān)系密切，其生存狀態(tài)及分泌睪酮的功能活動可在很大程度上影響、甚或體現(xiàn)睪丸的生殖活動［13］。因此，睪丸間質(zhì)細(xì)胞也通常作為研究藥物對睪丸分泌睪酮作用的體外模型［14］。但睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離純化一直是國際上進(jìn)行深入研究的瓶頸。本研究應(yīng)用邵冰玉等［5］的方法分離純化小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，因為他們應(yīng)用17-α羥化酶mRNA擴(kuò)增表明培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞具有較高純度。此外，本研究中對分離到的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后HE染色鏡檢，形態(tài)變化與劉玉志等［15］報道的相同，因此在本實驗中未對相同方法分離培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。另外，本研究選用4～5周齡成年小鼠，此時睪丸中間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和分泌能力均達(dá)到高峰［16］，便于研究藥物對間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的影響。本研究結(jié)果顯示，超過10 μg/mL甘草提取物濃度對體外原代培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長和睪酮分泌均具有顯著抑制作用，且隨藥物濃度增加和培養(yǎng)時間延長，抑制作用越加明顯。需要提及的是，本研究用的自制甘草浸膏所含的甘草提取物中除了具有對雄性生殖細(xì)胞具有影響的甘草甜素、甘草次酸等藥效成分外，還含有多種非療效成分。本研究采用超聲提取法和樹脂吸附技術(shù)將藥用甘草自制成浸膏，浸膏中無甘草成分以外的其他對細(xì)胞有害的成分，也沒有將甘草中的其他非療效成分去除，結(jié)果雖然不能完全反應(yīng)僅為甘草中甘草甜素或甘草次酸對雄性的毒性作用，這是本研究存在的一個缺陷。但我們認(rèn)為，這樣制成的甘草浸膏更能反應(yīng)甘草對男性生殖的毒性。欲知非療效成分對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性，可能還需進(jìn)一步分離甘草中非療效化合物對睪丸細(xì)胞毒性進(jìn)行追蹤研究。但可以肯定的是，在進(jìn)行細(xì)胞體外研究時，甘草浸膏的最低毒性劑量僅為10 μg/mL，而甘草中主要化學(xué)成分是甘草甜素和甘草次酸，故其受試物中療效成分的含有量已較低，非療效成分含有量更低，因而也不會對雄性生殖細(xì)胞產(chǎn)生很大的毒性。

然而，僅憑在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中添加藥物所表現(xiàn)出的對睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞的生長抑制作用很難斷定該藥物對在體睪丸具有生殖毒性作用，要確切了解甘草對睪丸的生殖毒性作用，需要進(jìn)一步研究甘草對在體睪丸的毒性作用。

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