HPLC法測定4種益母草制劑中鹽酸水蘇堿及其標準方法評價

包小紅，周娟，伍丕娥

(四川省食品藥品檢驗所，四川成都610097)

益母草為唇形科益母草屬植物Leonurus japonicusHoutt.的地上部分，原名茺蔚，據文獻［1-2］可知，其主要化學成分為生物堿類(鹽酸水蘇堿、益母草堿、益母草定、益母草寧等)、黃酮類、二萜類、甾醇、有機酸、多種微量元素及脂肪。其中鹽酸水蘇堿是主要的活性成分之一，具有活血調經，利尿消腫，收縮子宮的作用，該成分的定量測定方法在《中國藥典》2010年版一部“益母草”項下已有收載［3］。

益母草制劑涉及的現行標準見表1［4-6］。針對標準的現狀，參照文獻［7-8］，對4種益母草制劑中的鹽酸水蘇堿的定量測定方法進行了研究和統一。

表1 益母草制劑的現行標準

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters2695高效液相色譜儀-Waters2487紫外檢測器(美國Waters公司)，Empower工作站;Agilent1200高效液相色譜儀-AgilentDAD檢測器(美國安捷倫公司)，Chem-Station工作站;Agilent1200高效液相色譜儀-Alltech ELSD2000檢測器，Chem-Station工作站。

1.2 試藥甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。鹽酸水蘇堿對照品為中國藥品生物制品檢定所提供(批號110712-200709，含量測定用，含量以99.0%計，使用前于五氧化二磷減壓干燥12 h以上)。

2 溶液制備

2.1 對照品溶液取鹽酸水蘇堿對照品適量，精密稱定，加入甲醇制備成質量濃度為0.960 8 mg/mL的溶液，作為對照品貯備液。其他不同質量濃度的對照品溶液由貯備液稀釋得到。

2.2 供試品溶液取益母草顆粒粉末約1 g(或益母草片粉末0.5 g，益母草膠囊內容物0.5 g，益母草膏1 g)，精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入0.5%鹽酸甲醇25 mL，稱質量，超聲30 min，放冷，用0.5%鹽酸甲醇溶液補足減失的質量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。或取益母草軟膠囊內容物適量，混勻，取約2 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，置水浴中微熱，充分振搖，放冷，濾紙濾過，續濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

3 色譜條件

采用Agilent SCX300陽離子交換(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀-磷酸(15∶85∶0.15)為流動相;檢測波長192 nm;柱溫30℃。在上述色譜條件下各色譜峰分離良好，輔料空白無干擾。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

4 方法學考察

4.1 線性關系及定量限考察分別精密量取上述一系列質量濃度的對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積，并以峰面積為縱坐標，進樣量(μg)為橫坐標，進行回歸，得回歸方程:Y=279 635.8X+37 818.6r=0.999 7。結果表明:鹽酸水蘇堿在0.238～19.04 μg范圍內進樣具有良好的線性關系。由于本次樣品的水蘇堿含量差異大，有些極低，因此我們確定了一個定量限:精密量取鹽酸水蘇堿對照品(1.38 μg/mL)20 μL，按選定方法測定，結果S/N≈10，因此本品定量限為27.6 ng。

4.2 精密度試驗精密吸取對照品溶液(0.430 5 mg/mL)5 μL，按上述色譜條件中方法測定，連續進樣5次，峰面積RSD為0.19%。

4.3 穩定性試驗取已配制好的鹽酸水蘇堿對照品溶液(0.402 2mg/mL)5 μL和供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下，分別于0、4、8、16 h進樣，記錄峰面積，結果各溶液峰面積的RSD分別為1.75%(對照品)、1.66%(益母草顆粒)、1.66%(益母草膏)、1.42%(益母草片)、0.98%(益母草膠囊)。

4.4 耐用性試驗取各劑型的同一批樣品，分別采用不同的HPLC色譜儀和SCX色譜柱進行測定，結果見表2。

表2 不同色譜儀和色譜柱的考察結果

4.5 重復性試驗取各劑型同一批號樣品，按上述溶液制備項下的方法制備供試品溶液，各制備6份，按上述色譜條件測定，結果樣品中含鹽酸水蘇堿量分別為5.051 mg/g、RSD為0.73%(益母草顆粒)，3.913 mg/g、RSD為1.39%(益母草膏)，15.647 mg/g、RSD為0.69%(益母草片)，23.784 mg/g、RSD為0.61%(益母草膠囊)。

4.6 加樣回收試驗精密量取鹽酸水蘇堿對照品溶液(1.205 mg/mL)1.3、1、2、3 mL，各6份，分別置150 mL具塞錐形瓶中，水浴上揮干甲醇。分別取已知含有量的益母草顆粒細粉(質量分數為5.051 mg/g)0.5 g，益母草膏(質量分數為3.913 mg/g)0.5 g，益母草片細粉(質量分數為15.647 mg/g)0.25 g，益母草膠囊細粉(質量分數為23.784 mg/g)0.25 g，各6份，精密稱定，置上述具塞三角瓶中，精密加0.5%鹽酸甲醇25 mL，稱定質量分數量，其余照供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，并按下列公式計算回收率，結果回收率分別為99.0%、RSD為0.98%(益母草顆粒)，98.1%、RSD為2.00%(益母草膏)，99.5%、RSD為1.79%(益母草片)，102.0%、RSD為0.79%(益母草膠囊)。

4.7 樣品測定依據建立的鹽酸水蘇堿定量測定方法，對212批益母草顆粒、60批益母草膏、14批益母草片、12批益母草膠囊及8批益母草軟膠囊進行了考察。結果益母草顆粒含鹽酸水蘇堿量在0.04 mg/g～10.94 mg/g之間，益母草膏含鹽酸水蘇堿量在2.8 mg/g～11.2 mg/g(標準規定為不得少于3.6 mg/g)之間，益母草片含鹽酸水蘇堿量在8.4 mg/g～13.9 mg/g之間，益母草膠囊含鹽酸水蘇堿量在13.8 mg/g～23.1 mg/g之間，益母草軟膠囊含鹽酸水蘇堿量在7.5 mg/粒～9.6 mg/粒之間，其中益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含有量差異極大。

5 討論

5.1 曾參照《中國藥典》2010年版一部“益母草”含量測定項下鹽酸水蘇堿的檢測方法，采用丙酰胺基柱，蒸發光檢測器測定，測定條件為流動相乙腈-水(80∶20);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;空氣體積流量2.0 L/min;漂移管溫度80℃，對益母草顆粒和益母草片的水蘇堿含有量進行了重復性考察，結果分離度高，重復性良好，且兩種方法所測定的含有量結果(采用相同的供試品溶液進行比較)相近。但是，由于采用蒸發光檢測器時計算較復雜，且該儀器的普及率較紫外低，因此我們最終選定了紫外檢測器作為檢測方式。

5.2 提取溶劑分別考察了無水乙醇、70%乙醇、0.5%鹽酸乙醇、0.5%鹽酸甲醇、1%鹽酸甲醇和甲醇，結果溶劑為0.5%鹽酸甲醇時，水蘇堿的提取效率最高。

5.3 益母草顆粒現行標準(本次試驗涉及的樣品執行的標準為部標［6］，現已收載入《中國藥典》2010年版一部，增加了水蘇堿的薄層鑒別及含測項目)中檢測項目嚴重缺失，除了常規檢查項，就只有一個生物堿的化學鑒別反應，專屬性差，控制水平低，因此產品質量混亂，含有量差異極大，而其它劑型因標準中均對水蘇堿含有量或生物堿含有量作出了控制，產品質量情況相對較好。結果表明標準的完善和有效性對藥品質量的控制有著重要的作用。

5.4 益母草片、膠囊現行標準中的定量測定方法均采用的是雷氏鹽沉淀，以重量法或紫外分光光度法測定其總生物堿的含有量，專屬性差。益母草膏現行標準中的水蘇堿定量測定采用的是薄層掃描法，該法在操作過程所受影響因素較多，可操作性較差，薄層板展開時，展開劑的比例和展開環境(溫濕度)，薄層板固定相的厚度和緊密度，顯色時所噴顯色劑的量和在薄層板上的均勻度，均要影響最終的測定結果，該法重復性較差，容易造成結果的誤差，難以正確把握產品的含有量，本實驗采用了HPLC法測定水蘇堿，前處理簡單，方法統一，結果準確，重復性好，測定結果可以有效地反應不同劑型或同一劑型樣品之間的質量差異。

5.5 益母草軟膠囊本次樣品涉及3個標準(國家藥品標準YBZ29422005-2010Z，國家藥品標準YBZ00722009及批件2009B00079，國家藥品標準YBZ29422005-2010Z)，其中定量測定方法各不相同(見表1)。從標準中看，含藥材量(每粒)最高的樣品其規定的含測限度反而較低，按照標準測定該樣品，其測定結果也較別家樣品低，仔細分析原因后發現，該標準樣品前處理方法較復雜，可操作性及重復性較差，可能導致其測定結果偏低。按照統一的定量測定方法對上述3個標準的樣品進行考察，結果樣品含有量的高低與其每粒所含藥材量的高低完全一致.因此，檢驗方法不合理，則檢驗結果難以真實反應產品的質量;方法不一樣，則檢驗結果相互之間也缺乏可比性。

［1］南京中醫藥大學.中藥大辭典下冊［M］.上海:上海科學技術出版社，2006:2695.

［2］國家中醫藥管理局.中華本草精選本下冊［M］.上海:上海科學技術出版社，1998:1601.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:272.

［4］國家藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑第13冊［S］.1997:175.

［5］國家藥典委員會.國家藥品標準新藥轉正標準21分冊［S］.2002:521.

［6］國家藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑第7冊［S］.1993:141.

［7］嚴優芍，李衛民.HPLC法測定益母草分散片中鹽酸水蘇堿的含量［J］.廣東藥學院學報，2006，22(6):604-606.

［8］張韻，黃瑞紅.HPLC法測定安坤益母草片中鹽酸水蘇堿的含量［J］.廣東藥學院學報，2008，24(1):20-21.