星點設計-效應面法優化穿心蓮總內酯固體脂質納米粒處方

盛歡歡，鄒小廣，楊濤，李巖，程雪梅，王崢濤，王長虹*

(1.上海中醫藥大學中藥研究所;中藥標準化教育部重點實驗室;中藥新資源與質量標準綜合評價國家中醫藥管理局重點研究室;上海市復方中藥重點實驗室，上海201210;2.新疆喀什地區第一人民醫院，新疆喀什844000;3.新疆醫科大學藥學院藥劑教研室，新疆烏魯木齊830054)

星點設計(Central composite design，CCD)是近年來常用的試驗設計方法［1-3］，可以解決均勻設計和正交試驗設計的不足，既較好地保證了試驗精度，又可以分析各因素之間的相互作用，同時試驗次數也較少。效應面優化法(Response surface methodology，RSM)是集數學和統計學方法于一體的優化方法，通過描繪效應對考察因素的效應面，依據該模型可以描繪三維效應面圖(或稱因變量面圖)或二維等高線圖，從效應面或等高圖上選擇較佳的效應區，從而回推出自變量取值范圍(即最佳實驗條件)。

穿心蓮總內酯(Total lactones from Andrographis paniculata，TLA)是從爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata(burm.f.)Nees中提取的有效成分［4-5］，主要包括穿心蓮內酯(Andrographolide，AND)、新穿心蓮內酯(Neoandrographolide，NEO)、14-去氧穿心蓮內酯(14-Deoxy-andrographolide，DEO)和脫水穿心蓮內酯(Dehydroanddrographolide，DEH)等，具有抗菌、消炎、抗腫瘤等多種藥理活性［6-7］。為了提高其生物利用度，人們對穿心蓮總內酯自微乳、自乳化軟膠囊、滴丸、β-環糊精包合物、脂質體等新劑型進行了廣泛的研究［8-13］。如穿心蓮內酯自微乳使其生物利用度相對于其片劑提高了1.16倍［8］，脫水穿心蓮內酯琥珀酸半酯脂質體使其生物利用度相對于溶液劑提高了1.19倍［13］。但是，微乳、脂質體等制劑具有穩定性差等缺點。固體脂質納米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)是近年發展的一種新型納米載藥體系，它以天然的或人工合成的固體脂質(如飽和脂肪酸甘油酯、硬脂酸、混合脂質等)為載體，將藥物吸附或包裹于脂質核中制成的納米給藥體系［14-17］。具有控制藥物釋放、提高藥物的穩定性和生物利用度、降低藥物的毒副作用等優點。因此，本實驗旨在采用星點設計-效應面優化法優化穿心蓮總內酯固體脂質納米粒(TLA-SLN)處方，為進一步提高其藥物穩定性及生物利用度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters 高效液相色譜儀(Empower Pro色譜數據工作站，996二極管陣列檢測器，600四元泵，717plus自動進樣器，在線脫氣機，Waters Co.);NS 1001L Panda 2K型高壓勻質機(意大利Niro Soavi);EYELA旋轉蒸發儀(東京理化公司);SHB-III循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);DK—S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司);5415R離心機(Eppendorf，德國);BP211D Sartorius電子天平(Sartourius Co.GM);ODS分析色譜柱Kromasil-C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm);超純水器(Millipore公司);Millipore超濾離心管(Microcon YM-10，MWCO為10 kDa，USA)。

1.2 藥品與試劑穿心蓮內酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110797-200307);新穿心蓮內酯對照品(上海中藥標準化研究中心，純度≥98.5%);14-去氧穿心蓮內酯對照品(北京美迪克斯生物技術有限公司，批號:DXP28001);脫水穿心蓮內酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110854-200306);單硬脂酸甘油酯(中國醫藥集團上海化學試劑公司，批號:F20100210);卵磷脂(上海國藥集團化學試劑有限公司，批號:F20100910);山崳酸甘油酯(Compritol 888 ATO，批號:3123PPD);Tween-80(上海國藥集團化學試劑有限公司，批號:F20091214);無水甲醇(上海國藥集團化學試劑有限公司，批號:F20100914);無水乙醇(上海國藥集團化學試劑有限公司，批號:F20101017);乙腈(色譜純，Fisher);穿心蓮總內酯提取物(含穿心蓮總內酯50%，批號:XC090701西安小草植物科技有限公司);穿心蓮總內酯固體脂質納米粒(自制，批號分別為20110105-1，20110105-2，20110105-3)。

2 方法與結果

2.1 穿心蓮總內酯固體脂質納米粒的制備采用冷卻高壓均質法(Cold-high pressure homogenization technique)制備穿心蓮總內酯固體脂質納米粒。稱取處方量的山崳酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、穿心蓮總內酯，在(80±2)℃水浴下溶于適量無水乙醇中，揮除溶劑，迅速移至冰箱(－20℃)中冷凍2 h。取一定量的Tween-80分散于水中，形成均勻的水相，加入上述制得的固體，用高速分散器10 000 r/min分散為均勻的初乳，室溫條件下高壓均質機600 bar均質7次，冰浴迅速冷卻，即得穿心蓮總內酯固體脂質納米粒。

2.2 包封率的測定參考前期建立的穿心蓮總內酯固體脂質納米粒包封率和載藥量測定方法［18］，采用HPLC法測定穿心蓮總內酯固體脂質納米粒的包封率，對處方組成進行優化。

2.3 穿心蓮總內酯固體脂質納米粒的處方篩選在預試驗的基礎上，選擇對穿心蓮總內酯固體脂質納米粒性質影響較顯著的3個因素為考察對象，即藥脂比%(X1)、磷脂脂質比(X2)、Tween-80在水中的質量分數(X3)。根據預試驗結果及在最高或最低水平時制備穿心蓮總內酯固體脂質納米粒的可行性，綜合選擇各因素的水平(見表1)，以穿心蓮內酯的包封率(Y1)、新穿心蓮內酯的包封率(Y2)、14-去氧穿心蓮內酯的包封率(Y3)和脫水穿心蓮內酯的包封率(Y4)的滿意度函數為評價指標(表2)，對試驗結果進行擬合分析。

當指標較多時，根據每個指標優選的條件可能相互矛盾，對某一效應有利的條件可能對其他效應不利，各效應間需要達成妥協，使所有指標綜合為一個值，該值可反映總體效應結果。數據處理辦法為滿意度函數法［3］，每個指標均標準化為0～1間的滿意度函數(desirability function，DF)，各指標滿意度函數求算幾何平均數，得總評滿意度函數。本實驗有4個指標，所以DF=(d1d2d3d4)1/4。對取值越小越好的因素和取值越大越好的因素分別進行數學轉換求滿意度函數dmin和dmax。本實驗對4個指標成分的包封率進行歸一化處理，包封率要求越大越好，所以使用dmax=(Yi－Ymin)/(Ymax－Ymin)。考慮到4個指標對總評滿意度函數的貢獻不同，將每一個指標成分的滿意度函數乘以權重系數(按照提取物中4個指標成分的量而定，即穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的權衡系數分別為0.516 0、0.058 8、0.016 2和0.018 2)，得總評滿意度函數值見表2。

表1 星點設計因素與水平Tab.1 Factors and levels for central composite design

表2 星點實驗設計與結果Tab.2 Arrangement and results of central composite design

2.4 模型擬合應用Design Expert 7.0軟件，以DF值為因變量對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合分析。

多元線性擬合回歸方程為:Y=8.962 0×10－3+3.690 8×10－3X1－2.642 4×10－3X2+3.347 7×10－3X3，相關系數(R)為0.624 5，P＜0.05。

多元二項式擬合方程為:Y=－0.033 8+0.023 7X1－0.034 1X2+4.076 7×10－3X3+1.899 0×10－3X1X2－2.116 1×10－3X1X3+0.015 3X2X3－1.147 4×10－3－0.011 2－8.417 0×10－4，相關系數(R)為0.947 8，P＜0.001。

二元非線性方程擬合度較高，最終選擇二元非線性方程擬合，并繪制效應面圖(圖1～圖3)。由于三維圖只能表示效應對其中二個因素的關系，通常的處理方式是將另一個因素置為中心值，再描繪效應面，結合實驗數據DF值(范圍0.041～0.053)在圖上選取較佳處方范圍:X1=8.45%～10%，X2=0.82%～1.25%，X3=3.00%～4.16%。綜合評價，得最佳工藝參數為:X1=10%，X2=1.25%，X3=4%。根據包封率的特性，設定各成分包封率的區域:Y1=74%～90%;Y2＞90%;Y3＞90%;Y4＞90%。然后按此要求重疊各指標的二維等高線圖，得到能同時滿足以上條件的最佳區域見圖4。

由圖1～圖3可看出，三維效應圖均為曲面，說明藥脂比(X1)、磷脂脂質比(X2)、Tween-80在水中的質量分數(X3)和DF值呈非線性關系。圖1表明隨著X1的增大，DF先逐漸增加，后降低。圖2說明隨著X3增大，DF逐漸增大，X1的增大，DF先增大再降低。圖3隨著X2，X3的增大，DF逐漸增大。X1，X2，X3用量不同對各指標成分包封率的總評滿意度函數的影響不同。

由重疊等高線圖(圖4)可知，白色區域既是各成分包封率的區域重疊部位，也是選擇處方的最佳區域。其進一步縮小了處方的優化區域，大大提高了工作效率。

圖1 藥脂比(X1)和磷脂脂質比(X2)對DF值的三維效應面圖(A)和二維等高線圖(B)(Tween-80為3%)Fig.1 Predicted response surface scheme(A)and contour map(B)of independent variables of X1and X2as entrapment efficiency(with 3%Tween-80)

圖2 藥脂比(X1)和Tween-80在水中的質量分數(X3)對DF值的三維效應面圖(A)和二維等高線圖(B)(磷脂脂質比為1.25∶1)Fig.2 Predicted response surface scheme(A)and contour map(B)of independent variables of X1and X3as entrapment efficiency(with lecithin∶lipid=1.25∶1)

圖3 磷脂脂質比(X2)和Tween-80在水中的質量分數(X3)對DF值的三維效應面圖(A)和二維等高線圖(B)(藥脂比為7%)Fig.3 Predicted response surface scheme(A)and contour map(B)of independent variables of X2and X3as entrapment efficiency(with drug∶lipid:7%)

圖4 穿心蓮總內酯固體脂質納米粒處方優化的重疊等高線圖(X3=4%)Fig.4 The overlapping contour map of the optimal TLA-SLN formulation(X3=4%)

2.5 優化工藝驗證照上述優化處方(穿心蓮總內酯50 mg;單硬脂酸甘油酯250 mg;山崳酸甘油酯250 mg;卵磷脂625 mg;4%Tween-80 50 mL)采用冷卻-均質法制備3批穿心蓮總內酯固體脂質納米粒，測定包封率總評滿意度函數的預測值與實際值的相對偏差見表3。由表3可知，偏差的絕對值均小7%，說明實驗所得擬合方程可以很好的預測各因素和評價指標之間的關系。

表3 優化處方評價指標的預測值和實測值(n=3)Tab.3 Comparison of the observed and predicted values of the optimum formulations

按照優化處方3批穿心蓮總內酯固體脂質納米粒，經過分析測定結果表明，穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的包封率分別為(80.04±0.70)%、(94.94±3.87)%、(92.17±1.61)%、(97.64±0.68)%，載藥量分別為(4.11±0.04)%、(0.56±0.02)%、(0.15±0.00)%、(0.18±0.00)%［16］。平均粒徑為(322.67±2.50)nm，Zeta電位為(－17.98±1.19)mV。

3 討論

選擇適合于非線性擬合的實驗設計方法，可以提高優化效果，減少試驗次數，預測性好。星點設計就是一種較為成熟的方法。根據其所建立的數學模型描繪效應面，直接讀取較佳工藝條件區域。多個效應所選擇的較佳條件通過疊加，可以進一步縮小較佳條件范圍［19］。本實驗采用星點設計安排實驗，數據采用效應面法來進行處理，用多元線性方程和二項式方程來對數據分別進行擬合，從擬合方程的相系數R值可見，4個指標采用二項式方程擬合效果較好。

本實驗以穿心蓮總內酯中的穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯4種已知可定量的成分為研究對象，以其包封率為指標優化穿心蓮總內酯固體脂質納米粒的處方。若將全部的影響因素看成一個整體(單位1)，4個已知成分(穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯)在穿心蓮總內酯中占到總量的61%，而其余的39%為未知成分。在計算滿意度函數時，穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的權衡系數分別取值為0.516 0、0.058 8、0.016 2和0.018 2，其總和為0.61。當將這些可定量測定的指標成分作為一個固定的影響系數的整體來看待時，即相當于提取物中其它未知成分(占39%)的影響系數也隨之確定。依此對穿心蓮總內酯固體脂質納米粒的處方進行了優化，為其它多指標成分的中藥提取物制劑處方優化提供了一種有效的實驗設計方法的參考。

從驗證實驗結果可以看出，穿心蓮總內酯中的4個主要成分穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的包封率分別為(80.04±0.70)%、(94.94±3.87)%、(92.17±1.61)%、(97.64±0.68)%。從4個成分的結構可以看出，新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯與穿心蓮內酯相比，均是在穿心蓮內酯分子結構中的14位去羥基化后得到的一系列衍生物，而使分子極性發生了變化。說明不同成分的理化性質特別是脂溶性與其包封率差異密切相關。

將溶解度低、吸收不良、穩定性欠佳的藥物進行納米化是提高其生物利用度的途徑之一。本實驗對穿心蓮總內酯固體脂質納米粒的處方進行了研究，但其生物利用度如何，還有待于進一步考察和評價。

［1］Aberturas M R，Molpeceres J，Guzman M，et al.Development of a new cyclosporine formulation based on poly(caprolactone)microspheres［J］.J Microencapsul，2002，19(1):61-72.

［2］劉艷杰，向榮武.星點設計效應面法在藥學試驗設計中的應用［J］.中國現代應用藥學雜志，2002，24(6):455-457.

［3］宗志宇，何楨，孔祥芬.產品設計中多響應優化方法的比較研究［J］.組合機床與自動化加工技術，2005，46(12):1-3.

［4］陳麗霞，曲戈霞，邱峰.穿心蓮二萜內酯類化學成分的研究［J］.中國中藥雜志，2006，31(19):1594-1597.

［5］肖樹雄，王曉鈺，鄭劍紅，等.穿心蓮的成分及其分析方法研究概況［J］.中國藥師，2002，5(11):396-397.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:251.

［7］戴桂馥，王俊峰，何帥偉，等.穿心蓮內酯及其衍生物的藥理活性研究進展［J］.中成藥，2006，28(7):1032-1035.

［8］杜紅，牛欣，馮前進，等.穿心蓮內酯口服微乳與穿心蓮內酯片在家兔體內生物利用度的比較研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(3):217-219.

［9］孟慧，許勇.穿心蓮內酯自乳化軟膠囊的制備和溶出度評價［J］.藥學實踐雜志，2010，28(3):184-185.

［10］周家才，梁玉梅，周久培.HPLC法測定穿心蓮內酯滴丸中穿心蓮內酯的含量［J］.安徽醫藥，2004，8(4):284-285.

［11］王瑜真，張衛星，譚晶，等.β-環糊精包合穿心蓮內酯方法比較［J］.實用醫藥雜志，2004，21(1):45-46.

［12］于波濤，張志榮.穿心蓮內酯脂質體的制備及體外釋放特性［J］.中國醫藥工業雜志，2009，40(2):114-116.

［13］王志剛.脫水穿心蓮內酯琥珀酸半酯脂質體的研究［D］.沈陽藥科大學，2001.

［14］胡勤，彭芳，玲龍榮.固體脂質納米粒作為藥物載體的研究進展［J］.醫學臨床研究，2008，25(9):1701-1703.

［15］韓飛，劉洪卓，李三鳴.固體脂質納米粒和納米結構脂質載體在經皮給藥系統中的研究進展［J］.沈陽藥科大學學報，2008，25(10):839-844.

［16］Freitas C，Muller R H.Correlation between long-term stability of solid lipid nanoparticles(SLN)and crystallinity of the lipid phase［J］.Eur J Pharm Biopharm，1999，47(2):125-153.

［17］Gohia S H，Dingler A.Scaling up feasibility of the production of solid lipid nanoparticles(SLN)［J］.Pharmazie，2001，56(1):61-68.

［18］盛歡歡，楊濤，李巖，等.HPLC法測定穿心蓮總內酯固體脂質納米粒載藥量與包封率［J］.中成藥，2012，34(3):459-463.

［19］Siracha T，Ampol M，Teerakiat K，et al.Development and optimization of micro/nanoporous osmotic pump tablets［J］.AAPS Pharm Sci Tech，2010，11(2):924-935.