鈣激活性氯離子通道與高肺血流性肺動脈高壓*

陳傳斯， 龐玉生

(廣西醫科大學第一附屬醫院兒科，廣西南寧530021)

高肺血流性肺動脈高壓的形成主要是由于長期異常血流動力學改變引起肺動脈內皮損傷、肺動脈中膜平滑肌舒縮功能障礙和肺血管結構重構，進而使血管內徑變小，肺血管阻力增加，其中肺動脈平滑肌收縮是重要的成因。

肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)膜上有電壓依賴性Na+通道，多種Ca2+、K+和Cl－通道，這些通道的開關將直接或者間接影響血管平滑肌的生理功能。在肺動脈高壓的形成過程中，這些離子通道都扮演了很重要的角色，如使膜去極化、鈣離子內流和引起血管收縮。

氯離子是細胞內外含量最多的陰離子，它的跨膜轉運是一個非常重要的生理過程。已確認氯離子通道與血管平滑肌收縮功能及血管平滑肌細胞增殖密切相關。肺動脈平滑肌細胞膜上氯離子通道主要有鈣激活性氯離子(Ca2+－activated Cl－，ClCa)或鈣依賴性氯離子(Ca2+－dependent Cl－)通道和容量或腫脹敏感性氯離子(volume－or swelling－sensitive Cl－，Clswell)通道［1］，有研究表明，激活的鈣激活性氯離子通道有較強的去極化作用，在調控血管張力和收縮性方面起重要作用［2］。現就鈣激活性氯離子通道的生物物理和藥理學特點及其對高肺血流性肺動脈高壓的影響作一綜述。

1 鈣激活性氯離子通道的生物物理和藥理學特點

鈣激活性氯離子通道的激活閾值約為 －45 mV，在肺動脈平滑肌細胞中其分子屬于CaCC(calcium－activated chloride channel)，ClCA －2(chloride channel accessory 2);具有時間依賴性、鈣依賴性和電壓依賴性［3］。我們在膜片鉗實驗中發現，給予肺動脈平滑肌細胞在－100 mV～100 mV，階躍電壓為10 mV的去極化刺激后，在－50 mV左右時，可引出一瞬間電流(transient current，Itr)，之后出現一時間依賴性電流(time－dependent current，Itd);復極化后產生一長時間內向的尾電流(tail current，Itail)，經證實，Itd和Itail是由氯離子引起的，即鈣激活性氯離子電流［Ca2+－activated Cl－currents，ICl(Ca)］，這與國外同類研究結果相一致［2］。ICl(Ca)對鈣離子敏感:(1)細胞內鈣瞬間釋放時，會導致瞬時外向ICl(Ca)的激活;(2)當用含Ca2+的細胞外液灌流時，可引出ICl(Ca);當用無鈣含EGTA或含鋇細胞灌流液灌流時，ICl(Ca)消失或減少。

目前有2種假設機制用來說明ClCa通道在平滑肌細胞中是如何發揮興奮功能的［4－5］。第一種假設機制涉及由ClCa通道激動劑引起的血管收縮，與三磷酸肌醇受體(inositol triphosphate receptor，IP3R)通道有關。ClCa通道的激動劑有去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、內皮素 －1(endothelin －1，ET －1)、5－羥色胺(5－hydroxytryptamine，5－HT)、精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)等［1］。激動劑通過激活膜G蛋白偶聯受體Gq，使三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)作用于IP3受體通道，肌漿網(sarcoplasmic reticulum，SR)釋放 Ca2+，激活 ClCa通道，誘發ICl(Ca);而激活的ClCa通道使膜去極化，足夠促使電壓依賴性鈣通道開放，更多的鈣離子內流，引起平滑肌收縮。在這個正反饋循環中，激活的ClCa通道起著重要的作用，而肺動脈平滑肌細胞中鈣離子濃度也升高了200～1 000 nmol/L［2］。部分對血管平滑肌細胞ClCa通道的研究表明，它參與了去甲腎上腺素和內皮素等縮血管物質引起的大鼠腦動脈及兔腦動脈等血管收縮，可調節血管張力。Lamb等［6］在大鼠主動脈實驗中也證實去甲腎上腺素誘導的收縮與氯離子通道有關。第二種假設機制與肌漿網上ryanodine受體(ryanodine receptor，RyR)通道有關。RyR上存在特異性Ca2+－鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)磷酸化結合位點，CaMKⅡ能增強兔肺動脈［7］和冠狀動脈平滑肌細胞［8］上ICl(Ca)強度。咖啡因(caffeine)、ryanodine等通過影響Ca2+內流誘發Ca2+的釋放(內流的Ca2+觸發細胞內鈣池的Ca2+釋放)來發揮作用。但不同濃度的ryanodine所起的作用不一樣，低濃度 ryanodine(1 nmol/L ～10 μmol/L)使 RyR處于開放狀態，高濃度 ryanodine(0.3 mmol/L～2 mmol/L)使RyR關閉［9］。另外，從肌漿網表面 RyR通道產生的自發瞬時鈣釋放也可引發ICl(Ca)。

ClCa通道的阻滯劑有尼氟滅酸(niflumic acid，NFA)、anthracene－9－carboxylicacid(9－AC)、indaryloxyacetic acid(IAA －94)等［1］。其中，尼氟滅酸是ClCa通道的特異性阻滯劑，它可以減少激動劑誘導的血管收縮效應;濃度在10 μmol/L －100 μmol/L 便可引起細胞膜超極化及血管舒張。但對細胞外高鉀介導的收縮效應沒有影響［2］。

2 鈣激活性氯離子通道在高肺血流性肺動脈高壓肺動脈平滑肌細胞中的作用

在平滑肌細胞中，鈣激活性氯離子通道的平衡電位(－27 mV)較靜息膜電位(－60 mV)更“正”［10］，相對于其它離子來說，ClCa通道易被激活，它的開放將引起去極化的發生，足夠強的時候甚至可以使Ca2+通過電壓激活的Ca2+通道。

肺動脈高壓的病人或動物細胞內鈣離子濃度(intracellular calcium concentration，［Ca2+］i)相對于血壓正常的病人或動物要高［11］，楊朝等［12］經過實驗測出在常氧狀態下，PASMCs［Ca2+］i為(123.63 ±18.98)nmol/L，低氧時［Ca2+］i升高，達(281.75 ±16.48)nmol/L。［Ca2+］i的水平是決定 ClCa通道活性的關鍵因素［13］，它與ClCa通道活性互相影響，其相互作用對PASMCs有一定的調節作用。［Ca2+］i升高可激活ClCa通道，引起膜去極化，開放電壓依賴性鈣通道，細胞外鈣離子內流增加，對［Ca2+］i起正反饋作用，可啟動興奮收縮偶聯，最終導致肺血管收縮反應。眾多研究也發現，從caffeine敏感型鈣庫釋放Ca2+是低氧性肺血管收縮的早期事件，［Ca2+］i的升高優于低氧誘導的膜去極化作用［14］。

在高肺血流性肺動脈高壓模型中，左向右分流所產生的剪切力使肺血管阻力增高、肺動脈壓力增高、右心室負荷加重，甚至發生右心功能不全，會使組織出現缺氧。但無論是高肺血流，還是其導致的缺氧均可引起內皮功能紊亂，致血管收縮物質(如5－HT和ET－1等)釋放增加。杜軍保等［15］的研究表明，在大鼠高肺血流動物模型中，分流11周大鼠血漿ET－1含量及肺組織ET－1mRNA表達明顯升高。這些縮血管物質大多可激活ClCa通道，引起氯離子外流，細胞膜去極化，肺動脈平滑肌收縮效應增大。Sun等［16］最近發現，慢性缺氧可以增加ICl(Ca)的電流密度。ICl(Ca)可能介導肺動脈高壓中肺血管的過度反應［11］。我們通過腹主動脈－下腔靜脈造瘺術制備左向右分流高肺血流性肺動脈高壓大鼠模型，發現模型組大鼠PASMCs膜電位(約－37 mV)相對于對照組(約－48 mV)的要明顯增高，內向尾電流Itail和電流密度絕對值明顯增大，靜息膜電位(Em)與Itail和Itail電流密度呈密切相關關系，我們推測，在高肺血流性肺動脈高壓形成過程中，內向氯離子電流Itail絕對值的增大，成為復極化后膜電位絕對值降低的一個重要因素，使肺動脈平滑肌細胞易產生收縮反應，對肺動脈壓力的增高起了一定的作用。除此之外，莫碧文等［17］在應用氯離子通道阻滯劑三苯氧胺后，發現其可降低缺氧所致大鼠肺動脈壓升高、改善右心室肥厚。NFA對低氧人肺動脈［18］、自發性高血壓大鼠血管平滑肌［19］的收縮反應有抑制作用。其可能的機制:三苯氧胺或NFA直接抑制鈣激活性氯離子通道，使氯離子外流減少，增加細胞內側的負電荷，鈣離子內流減少，血管舒張。這提示我們，鈣激活性氯離子通道的開放或關閉在高肺血流性肺動脈高壓中起重要作用。

大量臨床和實驗研究證實，肺動脈平滑肌收縮是左向右分流肺動脈高壓的重要成因。在肺血管中，不同細胞群分布的ClCa通道數量不一樣，其中以阻力型肺動脈(第3級和第4級分支動脈)平滑肌細胞分布ClCa通道較多［20］。阻力型血管是肺血管張力調節的主要部位，激活的ClCa通道在調控血管張力和收縮性方面起重要作用。另有研究還發現，氯離子通道與血管平滑肌細胞增殖密切相關。李曉慧等［21］在對左向右分流所致肺動脈高壓大鼠的肺血管進行分析后發現，肺小動脈中肌型動脈的相對中膜厚度和相對中膜面積明顯高于對照組(僅開腹后暴露腹主動脈和下腔靜脈，不做動靜脈之間的穿刺)。Mercier等［22］在小豬身上也發現，高肺血流使肺動脈平滑肌細胞增殖，主要表現為遠端肺動脈內壁增厚。ClCa通道阻滯劑NFA可以通過抑制ClCa通道減慢細胞增殖［12］。因此，對于研究ClCa通道在這些肺小血管中的作用顯得更為重要。

3 鈣激活性氯離子通道特異性阻滯劑NFA對肺動脈高壓的影響

正常人血漿5－HT濃度在1～2 nmol/L，而在肺動脈高壓患者中5－HT可上升至30 nmol/L，此濃度足以使離體人肺動脈收縮。Marcos等［23］研究發現，在各種不同類型的嚴重肺動脈高壓病人已有肺動脈重塑的肺動脈中有很強的5HT－1B、5HT－2A、5HT－2B受體免疫染色。還有人發現，5－HT受體和5－羥色胺運載體主要在肺動脈平滑肌細胞內高表達。當5－HT作用于其受體，可引起Ca2+內流，引起血管收縮。另外，在狗、兔等動物實驗中發現，若靜脈內給予5－HT會增加肺血管的阻力。Yuan等［2］已證實，在大鼠肺動脈平滑肌細胞中，NFA可逆轉5－羥色胺所引起的膜去極化，使血管舒張。

NFA是環氧化酶抑制劑，用來抗炎鎮痛;同時還是氯離子通道阻滯劑，更被認為是ClCa通道的最強有力的阻斷劑［4］。為了驗證NFA對ClCa通道的抑制作用，楊朝等［24］通過類似實驗來證實。苯福林(phenylephrine，PE)與5－HT一樣，具有強的收縮肺循環的作用，可促進Ca2+內流和誘導細胞內鈣池Ca2+釋放，引起［Ca2+］i升高。NFA可以抑制由PE引起的血管收縮。他們發現在無Ca2+的細胞外液中，用1 μmol/L的PE就可以誘導急性分離所得的PASMCs的［Ca2+］i升高，但使用 NFA 后卻沒有對［Ca2+］i有影響。由此提示，NFA對肺血管的舒張作用與PE引起的［Ca2+］i的變化無關，而是由于抑制了 ClCa通道。

不僅如此，NFA對ClCa通道的抑制作用是非常強大的。2 μmol/L時對兔門靜脈細胞的ICl(Ca)抑制達50%［25］;10 μmol/L就幾乎能完全抑制大鼠肺動脈平滑肌上的ICl(Ca)［13］。即使［Ca2+］i濃度達250 ～500 nmol/L，Piper等［26］發現，濃度為 100 μmol/L 的NFA也能抑制其引起的氯離子外流。NFA還能通過抑制ClCa通道，關閉電壓依賴性鈣通道，使［Ca2+］i降低，減慢細胞增殖，改善肺小動脈增厚;降低門靜脈的平滑肌細胞自發收縮的幅度和頻率［27］。此外，NFA對心肌細胞也有影響，濃度為100 μmol/L時，能可逆性地抑制INa(voltage－gated Na+current)，影響動作電位的幅度［28］，可能起到抗心律失常的作用。還能夠抑制家兔竇房結細胞的If(超極化激活的離子電流)而具有減慢心率的作用。

但Ledoux等［8］發現，NFA可能具有雙重效應。2005年，他們在研究中發現，在兔肺動脈平滑肌細胞上，NFA既可以抑制ClCa通道，也可以刺激出現一個持續的呈濃度依賴性的ICl(Ca)。這個持續的ICl(Ca)在［Ca2+］i鉗制為500 nmol/L時激發，能被NFA(IC50=159 μmol/L)抑制，在去除NFA后以濃度非依賴性的方式短暫增加2倍。Liantonio等［29］研究結果表明，NFA在大鼠骨骼肌細胞中能促進線粒體鈣外流，增加基礎的［Ca2+］i。NFA的這些作用是否會影響到它對ClCa通道的抑制，再者，多少濃度的NFA才有可能把這些“副作用”減少到最低呢，還需深入研究。

4 小結

目前，對肺動脈高壓的治療不僅僅是單純考慮“降壓”，更重要的是把阻遏和逆轉肺血管重構作為治療標靶。在動物實驗中，一些物質對鉀離子、鈣離子通道的影響已被證實對預防和(或)逆轉肺動脈高壓有效。

隨著我們對鈣激活性氯離子通道功能的深入認識，它的各種特性將逐漸被闡明，有希望篩選出一類高選擇性地作用于肺血管、專門治療高肺血流性肺動脈高壓的新型藥物;已證實，抑制通過鈣激活性氯離子通道向外流的氯離子，對治療一些疾病及其后遺癥是有效果的［30］。作為鈣激活性氯離子通道的特異性阻滯劑，NFA也將會越來越受到重視。但我們也應該看到，目前大部分有關鈣激活性氯離子通道的研究都是針對低氧性肺動脈高壓或其它原因所引起的肺動脈高壓，對高肺血流性肺動脈高壓的探索還是很少的。NFA在高肺血流性肺動脈高壓中發揮調節ClCa通道活性及影響肺動脈張力等作用的具體機制尚待進一步研究。我們課題組將在往后的實驗中對此進行深入的研究。

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