HPLC法同時檢測血漿中半胱氨酸/胱氨酸和還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的氧化還原電勢

楊薈敏 祝佳瑋 趙宸龍 張晨光 張 紅 趙文明

(1.首都醫科大學基礎醫院細胞生物學系，肝臟保護與再生調節北京市重點實驗室，北京100069;2.首都醫科大學基礎醫院免疫學系，北京100069;3.首都醫科大學基礎醫學院，北京100069)

含有巰基/二硫鍵的化合物在體內發揮著多種不同的作用，可參與調控細胞信號傳導，蛋白質以及其他分子化合物等的組成、轉運和功能等。體內含有巰基/二硫鍵的化合物有半胱氨酸/胱氨酸(cysteine/ cystine，Cys/CySS)，谷胱甘肽氧化態/還原態(reduced glutathione/oxidized glutathione，GSH/GSSG)以及硫氧還原蛋白1和2(thioredoxin1/2，Trx1/2)［1］等，這些物質在體內環境中以氧化態和還原態的形式存在，處于動態變化的過程中并最終達到一個相對氧化還原平衡的狀態。一旦這種平衡狀態被破壞，機體即啟動與超氧自由基產物的相關機制，從而影響脂蛋白修飾、轉換和細胞功能及代謝素產生損傷［2-4］，而且可對葡萄糖和糖蛋白的自身氧化作用和抗氧化酶的糖化作用產生影響。

氧化應激參與體內多種生理活動及疾病的發生［5］，因此，尋找能夠探測體內氧化還原狀態生物學指標的簡單且準確的方法，對研究氧化應激參與的體內生理活動極為重要。目前，檢測體內某種蛋白氧化還原狀態的方法很多。應用比較廣泛的主要有氧化還原蛋白免疫印記法［5］;生物素標記的碘乙酰胺蛋白免疫印記法［6-7］;此外還有一些相關的測定方法如：酶循環法［8］、磁共振光譜檢測法［9］以及電化學測定法［10］等。但這些方法在某些方面如檢測靈敏度，相對精確定量蛋白的氧化還原狀態等受到實驗條件的限制，具有一定的局限性。并且在同時檢測體內多種物質的氧化還原狀態上也受到一定的限制。另外，目前國內文獻［8-10］報道主要集中在用HPLC檢測血漿中還原態物質如GSH、Cys等的含量。因此，尋找能夠同時測定體內多種氧化及還原狀態物質的方法對準確反映體內氧化應激的狀態極為重要。本方法可同時檢測血漿中含巰基/二硫鍵化合物 Cys/CySS和GSH/GSSG形成的氧化還原對的含量，并根據能斯特方程計算出相應的氧化還原電勢。此方法是用碘乙酸封閉血漿中自由的巰基，通過丹磺酰氯衍生化后，利用HPLC進行分離檢測。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

1)實驗材料：水合紅菲繞啉二磺酸鈉(bathophenanthroline disulfonic acid disodium salt hydrate，BPDS)，丹磺酰氯，L-絲氨酸，Cys，CySS，GSH，GSSG，70%高氯酸(HPLC級)，甲醇(HPLC級)均購于美國Sigma公司。內參谷氨酰谷氨酸(γ-glutamylglutamate，γ-GG)購于美國 MP Biomedicals公司，碘乙酸(iodoacetic acid，IAA)，肝素鈉購于北京信德科興科學器材有限責任公司，硼酸、四硼酸鈉、丙酮、氯仿、冰醋酸均為國產分析純級別。SD雄性大鼠(190～210g)購于首都醫科大學實驗動物部，實驗動物許可證號：2006－0009。

2)儀器：高效液相色譜儀為Wasters 2695，以及熒光檢測器Wasters 2475(激發波長315nm，發射波長518nm)。

1.2 主要試劑的配制

1)主要溶液的配制：①含有內參的硼酸鹽緩沖液(0.5 mol/L，pH 8.5)：稱取 12.4 g硼酸，19 g Na2B4O7·10 H2O，溶于500 mL雙蒸水中;加入內參γ-GG，終濃度為165 μmol/L。②A液的配制：稱取1.53 g L-絲氨酸，25 mg肝素鈉，50 mg BPDS，300 mg IAA溶于10 mL含有內參γ-GG的硼酸鹽緩沖液(0.5 mol/L)中，充分混勻(pH 8.0)。分裝為每管150 μL。于－20℃保存。③B液的配制：0.2 mol/L含有10%高氯酸的硼酸液：稱取6.2 g硼酸至300 mL雙蒸水中，加入71 mL 70%高氯酸混勻后，再用雙蒸水定容至500 mL(pH 1.0)。分裝為200 μL/管，于－20℃保存。

2)標準樣品的制備：精確稱取適量的Cys，CySS，GSH，GSSG溶解于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，制成濃度均為5 μmol/L的Cys，CySS，GSH，GSSG混合溶液。然后加入IAA和內參γ-GG，濃度分別為7.4g/ L和10 μmol/L。分裝，于－20℃保存。

3)血漿樣品的制備：取1 350 μL全血，加入150 μL A液，室溫放置一段時間，使IAA與巰基充分結合。將管輕輕倒置2次混合溶液，然后16 000g離心1 min。取上清200 μL，加入200 μL B液，再輕輕將管倒置2次，混勻后于－20℃保存。

1.3 實驗方法

1)樣品的衍生化：將標準樣品及血漿樣品取出，待樣品融化后，16 000g離心2min，取300μL上清置于新離心管中，加入1 mol/L KOH/飽和硼酸鹽溶液調節pH值至9.0±0.2，放置大約3min，充分清除高氯酸鉀。加入300μL丹磺酰氯溶液(20mg/mL丹磺酰氯溶于丙酮，現配現用)，室溫避光16～26 h，加入500μL氯仿，8 000 r/min離心 5min。取上清，于－20℃保存。

2)色譜條件：色譜柱為LC-NH2硅膠柱(25cm × 4.6mm，5μm，美國Sigma公司)。流動相I為80%甲醇，20%雙蒸水。流動相Ⅱ為63%甲醇，27%冰醋酸，10%雙蒸水，0.002 5mol/L無水乙酸鈉。流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度程序Tab.1 Procedure of solvent gradient (%)

2 結果

2.1 標準樣品的檢測及其重復性

為檢測本方法的可行性及重復性，我們首先對已知濃度的標準樣品中各組進行了檢測。按照1.2中2)的方法準確配制含有5 μmol/L Cys、CySS、GSH、GSSG，和10 μmol/L內標γ-GG的混合標準樣品，并將其分為5份，分別測定各樣品中Cys、CySS、GSH、GSSG以及γ-GG的保留時間和峰面積。以第1次結果和第5次結果為例作圖(圖1)。各組分的保留時間及峰面積見表2。用于標準定量的內標γ-GG在保留時間和峰面積上均顯示了極高的重復性，RSD值均≤1%，為后期樣品濃度的精確定量提供了基礎。Cys、CySS、GSH、GSSG的保留時間及峰型的RSD值也都≤10.8%，具有較好的重合性。實驗說明此方法可以準確檢測出標準樣品中各物質的含量，并且具有可重復性。

圖1 HPLC重復分離、熒光檢測標準品峰值圖Fig.1 Replicated peak of standard were separated and detected by HPLCRed：the result from the first time;Blue：the result from the fifth time;HPLC：high performance liquid chromatography;CySS：cystine;Cys：cysteine;γ-GG：glutamylglutamateGSH：reduced glutathione;GSSG：oxideided glucathione.

表2 重復性實驗Tab.2 Repeatability of the assay

2.2 標準樣品的穩定性檢測

分別測定新鮮配制的標準樣品與配制后置入－20℃保存90d的標準品，并對第1天和第90天的樣品濃度進行檢測，記錄峰面積，計算RSD值。經較長時間凍存后，與新鮮制備的標準樣品相比，GSH、GSSG、Cys、CySS的 RSD值分別為 7.5%，6.9%，6.4%和3.9%均小于10%，表明本方法制備的標準樣品在－20℃環境中具有較好的穩定性。

2.3 血漿樣品中Cys/CySS和GSH/GSSG的檢測

根據血漿樣品的制備方法1.2中3)制備HPLC大鼠血漿樣品，并按照1.3實驗方法分別檢測混合標準樣品、正常大鼠及帕金森大鼠模型的血漿樣品中Cys、 CySS、GSH、GSSG的含量，詳見圖2。利用內標法公式：

內標γ-GG(10μmol/L)，標準樣品中各物質的濃度(5μmol/L)，可 分 別 計 算 正 常 大 鼠 中 Cys (20.68 μmol/L)、 CySS (34.00μmol/L)、 GSH (25.3μmol/L)、GSSG(15.8μmol/L)和帕金森模型大鼠中 Cys(22.99μmol/L)、CySS(28.55μmol/L)、GSH (7.8μmol/L)、GSSG(18.5μmol/L)的含量。帕金森大鼠模型動物血漿中可能存在氧化還原電勢的改變。

圖2 HPLC分離、熒光檢測大鼠血漿中Cys，CySS，GSH，GSSG峰值圖Fig.2 Peaks of Cys，CySS，GSH，GSSG，in rat plasma were separated and detected by HPLCA：standard mixture containing each of Cys，CySS，GSH，GSSG at 5μmol/L and 10μmol/L internal standard，γ-GG;B：plasma sample from a healthy rat;C：plasma sample from a rat with Parkinson's disease;HPLC：high performance liquid chromatography;Cys：cysteine;CySS：cystine;GSH：reduced glutathione; GSSG：oxidized glutathione.

2.4 樣品中氧化還原電勢的計算

根據圖2中各實驗組測得的各組分的濃度，利用能斯特方程：Cys/CySSEh=－250+30 log［(CySS)/ (Cys)2］，GSH/GSSGEh=－264+30 log［(GSSG)/ (GSH)2)分別計算大鼠血漿樣品中的氧化還原電勢(圖3)。當血漿pH值為7.4時，正常大鼠的Cys/ CySSEh和GSH/GSSGEh分別為(－120.01±18.08) mV和(－131.60±2.45)mV，而在帕金森大鼠動物模型中Cys/CySSEh和GSH/GSSGEh分別為(－96.34± 9.98)mV和(－94.27±4.56)mV。與正常大鼠相比，帕金森大鼠動物模型血漿中 Cys/CySSEh和 GSH/ GSSGEh均發生了一定程度的氧化，進一步量化了帕金森大鼠動物模型中的氧化應激程度。

圖3 不同組間大鼠Eh值柱狀圖Fig.3 Histograms of rat plasma Eh in different experimental groupsControl：rats injected with DMSO;Model：rotenone-induced rat model of PD;male Sprague-Dawley rats received rotenone(6 μg) injection for 3 weeks;Eh：redox potentials;Cys：cysteine;CySS：cystine;GSH：reduced glutathione;GSSG：oxidized glutathione.

3 討論

含巰基/二硫鍵化合物在體內分布廣泛，其多功能性也越來越引起廣泛的注意。特別是近年來，活性氧、自由基以及氧化還原調控在體內的研究尤為重要［11］。目前國內文獻［12］報道的方法主要集中在用HPLC檢測血漿中還原態物質如GSH、Cys等的含量，未涉及相應氧化還原電勢的檢測。此外，疾病狀態下Cys/CySSEh與GSH/GSSGEh并非同時發生變化［13］，因此單獨檢測其中之一有可能對實驗的準確性造成影響。而本方法可同時測定血漿內氧化態和還原態物質Cys、CySS、GSH、GSSG的含量，并可反映機體氧化還原能力重要的量化指標(氧化還原電勢)。此方法的建立，為研究巰基依賴的氧化還原相關信號［1］提供了更加可靠的依據。

利用本研究方法制備樣品時應注意以下幾點：第一，在－20℃條件下，可維持樣品的穩定性4～5個月，樣品在－80℃條件下，則可穩定更長時間;第二，在樣品制備過程中用到的高氯酸，有k+存在時會出現沉淀，因此在制備好的樣品中如出現少量沉淀，并不會影響實驗結果的準確性;第三，為保證色譜柱的使用壽命，可在上機操作前，適當離心棄去沉淀;第四，本研究所用方法是基于陰離子交換柱的原理建立的，帶有不同負電荷的待測樣品可以被梯度洗脫下來。因此實驗成功的關鍵在于流動相Ⅰ與Ⅱ的比例。決定該比例的主要因素，除樣品所帶電荷數以外，還有色譜柱的柱齡。我們經過多次實驗發現，隨著柱齡的增加，待測樣品與色譜柱的結合能力逐漸減弱，為了能夠繼續達到較好的分離效果，保證實驗結果的準確性，可逐漸降低流動相中Ⅱ所占的比例。此外，在制備待測樣品的過程中，防止樣品制備過程中溶血現象的發生是實驗成功的另一關鍵部分。因為紅細胞中GSH的含量較血漿中高出很多。一旦樣品制備過程中出現溶血現象，樣品需丟棄，否則將嚴重影響實驗的準確性。

此方法可被廣泛用于測定與氧化應激相關的多種疾病，如肝損傷［14］、動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、皮膚病、糖尿病、呼吸系統疾病、神經系統疾病、骨關節炎、風濕性關節炎［15-17］等，以及在不同營養狀態和不同毒理學條件下，血漿、支氣管肺泡灌洗液、淋巴液、腦脊液中Cys/CySS和GSH/GSSG氧化還原對的含量及相應的氧化還原電勢，因而可成為檢測與氧化應激相關疾病及病理條件下的新的臨床診斷指標之一。

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