星點設計－響應面法優(yōu)選肺炎口服液的提取工藝

梁喆，張麗，呂艷莉，陳惠錚

(1．哈爾濱市兒童醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150010;2．黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

大黃牡丹湯為張仲景《金匱要略》中的一首名方，而肺炎口服液為大黃牡丹湯的加減方，方由石膏、甘草、綿馬貫眾、牡丹皮、蘆根、大黃、鉤藤、板藍根、地骨皮、蒲公英10味中藥組成，具清熱解毒、止咳定喘的功效，主治肺熱壅盛型病毒性肺炎、氣管炎。肺炎口服液是哈爾濱市兒童醫(yī)院特色中藥制劑，方中大黃瀉火逐瘀，通便解毒;牡丹皮涼血清熱，活血散瘀，二者合用，共瀉腸腑濕熱瘀結，共為方中君藥，且符合中醫(yī)肺與大腸相表里的理論。

中藥的提取及制備工藝最常用的優(yōu)化方法是正交設計法［1］和均勻設計法［2］，但是這兩種方法存在一定的不足。星點設計－效應面法作為優(yōu)選工藝的方法之一，彌補了正交設計法和均勻設計法的缺限，在國內外廣泛運用［3－6］。星點設計(Central Composite Design，CCD)采用線性或非線性擬合的實驗設計方法，可以減少試驗次數、并且提高了試驗的精密度。響應面分析法(Response Surface Methodology，RSM)是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間函數關系的一種統(tǒng)計方法，通過對響應面等值線的分析以尋求最優(yōu)工藝參數。本實驗以大黃酸、丹皮酚和芍藥苷的含量為指標，采用3因素5水平的星點設計表安排提取工藝實驗，結合響應面法優(yōu)選處方的提取工藝，為新劑型的開發(fā)提供依據。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

美國Waters高效液相色譜儀(2695溶劑管理系統(tǒng)，2996二極管陣列檢測器，美國Waters柱溫箱，Empower2工作站);PTHW型電子恒溫電熱套(鞏義市予華儀器有限公司);FA2004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司);DZG6050SA真空干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司);KQ－50B超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1．2 藥品與試劑

芍藥苷(110736－200933)、丹皮酚(110708－200506)、大黃酸對照品(0757－200206)(中國藥品生物制品檢定所);石膏、甘草、牡丹皮、大黃等10味藥材(哈藥集團世一堂飲片廠，經黑龍江中醫(yī)藥大學劉樹民教授檢驗，均符合《中國藥典》2010年版一部規(guī)定);水為重蒸水;甲醇(色譜純，天津四友試劑廠);其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2．1 芍藥苷、丹皮酚含量測定方法［7］

2．1．1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18色譜柱(4.6mm ×150mm，5μm);柱溫:40℃;流動相:甲醇 －0.05%磷酸水溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1;流速:1．0ml/min;進樣量:10μl;檢測波長:芍藥苷230nm，丹皮酚274nm。此條件下芍藥苷和丹皮酚色譜峰與相鄰成分可達基線分離。

表1 梯度洗脫時間程序

2．1．2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷和丹皮酚對照品，加甲醇制成每1m l分別含芍藥苷0.156mg、丹皮酚0.301mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2．1．3 供試品溶液的制備 取本品內容物約20ml，精密量取，置圓底燒瓶中，蒸發(fā)溶劑至干，殘渣加甲醇5m l溶解，并轉移至10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)過濾，取續(xù)濾液，即得。

2．2 大黃酸含量測定方法［8］

2．2．1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm);柱溫:30℃;流動相:甲醇 －0.1%磷酸溶液(85∶15);流速為 1．0ml/min;檢測波長:254nm;進樣量:10μl。

2．2．2 對照品溶液的制備 精密稱取大黃酸對照品適量，置10ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制成濃度為0.175mg/ml的溶液。

2．2．3 供試品溶液的制備 取本品內容物約20ml，精密量取，置圓底燒瓶中，蒸發(fā)溶劑至干，殘渣加2.5mol/l硫酸溶液20ml，置水浴中加熱回流2h，放冷，加氯仿20ml，回流30min，轉移至分液漏斗中，分取氯仿液，濾過，酸液再加氯仿提取3次，每次20ml，分別濾過氯仿液，最后用氯仿10ml分次洗滌濾器，合并氯仿液和洗液，加水30ml洗滌氯仿液，棄去水洗液，氯仿液蒸干，殘渣加甲醇5ml使溶解，并轉移至10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)過濾，取續(xù)濾液，即得。

2．3 星點試驗設計

根據工業(yè)化生產的實際，本實驗采用水提取法。實驗中提取次數和藥材粒徑為非連續(xù)變量，回歸處理困難，因此本試驗固定提取次數為2次，藥材粒徑以通過3號篩為準。根據預試驗結果，選擇醇沉濃度(X1)、料液比(X2)和提取時間(X3)3個因素為自變量，其中醇沉時的乙醇體積固定，料液比和提取時間主要是針對水提取工藝設計的因素，每個因素確定5個水平，共20個試驗點(6個中心點)，以芍藥苷、丹皮酚和大黃酸含量的總和作因變量考察指標，采用星點設計提取工藝條件，運用響應面分析法分析以尋求最優(yōu)工藝參數，因素水平編碼見表2，試驗安排和結果見表3。

表2 提取工藝因素水平編碼

2．4 數據分析 應用Design－Expert7．0．0軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得到醇沉濃度(X1)、料液比(X2)及提取時間(X3)與提取物總含量之間的二次多項回歸方程，回歸方程為:

Y=4．97+0．88X1+1．19X2+0．39X3+0．025X1X2+0．098X1X3+0．1X2X3+1．03X21+0．85X22+0.91X23

回歸方程系數 r2=0．947 5(r=0．973 3)，說明模型能解釋97．33%響應值的變化，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準確的預測實際情況。其校正決定系數(adj－R2)為0．900 2(r=0.948 7)，表明此模型能解釋94．87%效應值變化，因此該模型擬合程度良好。

對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結果見表3。表3回歸方程顯著性檢驗，P＜0.000 1，回歸方差顯著性檢驗表明，一次項醇沉濃度(X1)和料液比(X2)對提取物總含量的線性效應極顯著(P＜0.01);一次項提取時間(X3)，二次項中 X21，X22，X23對提取物總含量的曲面效應顯著(P＜0.05);醇沉濃度(X1)和料液比(X2)交互項(X1X2)、醇沉濃度(X1)和提取時間(X3)交互項(X1X3)、料液比(X2)和提取時間(X3)交互項(X2X3)的P值均大于0.05，說明各因素間的交互作用不顯著。

表3 星點試驗設計與結果

2．5 響應面分析及最優(yōu)提取條件的確定 依據回歸方程，在保持1個因素編碼值為0時，借助Design－Expert7．0．0軟件繪制其它2個因素與響應值關系的三維響應面圖，結果見圖1。由圖可以看出，醇沉濃度(X1)和料液比(X2)對提取物總含量的提取影響較為顯著，且響應曲面陡峭。

為確定這三個影響因素的最佳取值，通過Design－Expert7．0．0軟件分析，得出回歸模型存在最大值點，(X)的代碼值分別為0.02，－1.18，－1.40，與之對應的實測值醇沉濃度(X1)為75.76%，料液比(X2)為1∶9.19，提取時間(X3)為2.08h，此時肺炎口服液中提取物總含量的最大估計值為10.46mg/ml。

2．6 模型的驗證 為了驗證此提取模型方程的適用性，在醇沉濃度、料液比、提取時間最優(yōu)的水平上，重復試驗 3次，提取物總含量為 10．38mg/ml(RSD為0.37%)，與預測值10.46mg/ml吻合極好，說明用此模型指導實踐具有非常好的效果。

表3 回歸模型方差分析

圖1 各因素與響應值關系的三維響應面圖

3 討論

由于星點設計－響應面優(yōu)化法采用非線性模型擬合，在中心點進行重復性實驗的次數越多，越可以提高實驗的精確度，預測值越可接近真實值，故本實驗采用6次重復試驗。實驗方法簡便合理、穩(wěn)定，可預測性較優(yōu)。

根據口服液生產的實際，本提取工藝還考察了醇沉濃度對于藥效成分的影響。結果表明，醇沉濃度對于口服液生產的質量有很大的影響。

本試驗采用響應面分析法確定了星點設計優(yōu)化的肺炎口服液提取工藝的最優(yōu)條件:醇沉濃度(X1)為75.76%，料液比(X2)為 1∶9.19，提取時間(X3)為2.08h，在此條件下，肺炎口服液中提取物總含量的最大估計值為10.46mg/ml，試驗結果與模型預測值相符。

［1］魏小亮，胡久梅，毛霞．正交設計法優(yōu)選川芎揮發(fā)油的β－環(huán)糊精包合工藝［J］．中國實驗方劑學雜志，2011，17(5):46．

［2］廖國平，賀帥，張忠義．均勻設計法優(yōu)化超高壓提取虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇［J］．中國中藥雜志，2010，35(24):3282．

［3］徐秀泉，許源，湯建，等．響應面法優(yōu)化金蓮花總黃酮的超聲提取工藝［J］．中國實驗方劑學雜志，2011，17(14):35．

［4］陳衛(wèi)衛(wèi)，彭晶蕊，楊黎，等．星點設計－效應面法優(yōu)選消瘡顆粒劑的提取工藝［J］．遼寧中醫(yī)雜志雜志，2009，36(7):1188．

［5］張良蕾，姚倩，陳開曉，等．星點設計效應面法優(yōu)化槐花米中槲皮素提取工藝［J］．時珍國醫(yī)國藥，2010，21(8):2068．

［6］李晶，張洪霞，朱鴻敏，等．星點設計－效應面法優(yōu)化升陽散火湯提取工藝［J］．沈陽藥科大學學報，2010，27(5):392．

［7］李向陽，屠萬倩，張留記．RP－HPLC法測定不同產地的牡丹皮中芍藥苷和丹皮酚的含量［J］．中藥新藥與臨床藥理，2011，22(5):563．

［8］中華人民共和國藥典委員會．中華人民共和國藥典［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:22．