循環腫瘤細胞在乳腺癌中檢測和應用的研究進展

鮑慧錚 吳 靖 潘鵬濤 李 慧 紀 煒 徐 娜 李忠錕 于秀艷

(吉林省腫瘤醫院內五科，吉林 長春 130024)

循環腫瘤細胞在乳腺癌中檢測和應用的研究進展

鮑慧錚 吳 靖1潘鵬濤1李 慧 紀 煒 徐 娜 李忠錕 于秀艷

(吉林省腫瘤醫院內五科，吉林 長春 130024)

循環腫瘤細胞;乳腺癌;轉移

在我國，乳腺癌是導致婦女死亡的主要原因之一，其中遠處轉移的發生是導致乳腺癌患者死亡的最主要原因。然而，腫瘤細胞轉移機制目前尚不清楚。當前，腫瘤檢測手段嚴重依賴于影像學和血清標志物。基于腫瘤細胞播散理論，檢測循環腫瘤細胞(CTC)有可能早期發現腫瘤轉移和復發情況。因此，本文就相關的CTC成像、檢測技術和近期發現的CTC特性分子加以概述。

1 CTC概述

1869 年，Ashworth〔1〕發現癌癥患者血液中存在 CTC，現在腫瘤循環問題是一個癌癥研究的熱門話題，已廣為認同CTCs在腫瘤轉移和擴散中扮演著重要角色。乳腺癌中CTC檢測和枚舉已建立起一些臨床研究，結果顯示CTC與降低無進展生存率和總生存率在乳腺癌手術之前和化療后相關。Cristofanilli等〔2〕研究表明CTC檢測在評估轉移性乳腺癌疾病進展和生存的重要性。

CTC分析對于晚期癌癥患者是一種很有前景的新診斷領域。然而，由于CTC非常少，且可用的樣本數量非常有限，這對CTC分析提出了強大的分析和技術挑戰。最近CTC檢測和表征技術的進步包括RT-qPCR、影像學、微型濾波器和微芯片設備。高解析敏感CTC平臺允許監測疾病檢測和治療的有效性。

CTCs是新興的腫瘤標志物，本質上提供一個“流動性”活檢樣本，對有希望的個性化治療進行監測。此外，CTCs對于理解腫瘤生物學和腫瘤細胞傳播是非常好的靶目標。CTCs的分子特性提供了一種令人興奮的方法來更好地理解生物學轉移和抗常規療法，新的治療靶點可由CTCs與腫瘤干細胞(TSCs)的關系確定。進一步研究CTCs分子特性應該有助于更好地理解癌癥患者生物學的轉移性發展。

2 CTC分離富集和檢測

由于CTC在血液中含量極少，作為小概率事件其遵循泊松分布〔3〕。為了準確地檢測這些細胞，高效率和標準化檢測方案是絕對必要的。泊松分布適合于描述單位時間內隨機事件(細胞)發生的次數〔3〕。目前，已經開發出一種采用泊松分布對血液收集和統計分析的模型，此模型運用在CTC分析和檢測的各個步驟中〔3〕。一般來說，CTCs檢測包括兩個主要部分：富集分離和檢測。本文主要介紹當前CTC檢測常用方法。

2.1 CTC分離和富集

分離和富集CTCs常用方法是密度梯度離心法和免疫磁珠法，各有利弊。兩種方法的組合檢測技術已應用到CTC檢測，如，CTCs用Ep-CAM抗體磁珠富集后，在外加磁場的作用下從血液中被分離出來。然而，許多研究表明：受腫瘤類型和異質性的影響，一些腫瘤細胞Ep-CAM表達缺失，采用此種方法進行陽性篩選可能會產生誤差〔4～6〕。

2.1.1 免疫磁珠富集分離法 該方法的基本原理是腫瘤細胞表明的特異性抗原能與連接磁珠的相對應抗體相結合，繼而在外加磁場作用下相應的抗原抗體復合物被磁珠吸附而停留在磁場中，而表面不表達該抗原的細胞由于不能與連有磁珠的單抗特異性結合而沒磁性，不能滯留在磁場中，進而使腫瘤細胞進行富集和分離。目前，大多數CTCs檢測采用陽性分方法，它基于腫瘤細胞表明特異性表達的EpCAM抗體而進行的〔4〕。然而，一些低表達或不表達EpCAM的腫瘤細胞無法采用此方法進行分離。因此，評價CTCs作為乳腺癌預后標志物時，應包含EpCAM陽性和陰性兩種亞種類〔5〕。最近研究結果表明，與其乳腺癌亞型相比，一些形態類似正常細胞的乳腺癌細胞株不表達EpCAM表達，因此基于EpCAM抗體的捕獲技術檢測不到這種細胞〔6〕。Mostert等〔7〕發現在乳腺癌患者中聯合使用 CD146和抗-EpCAM兩種標志物，可提高CTC檢測效率。Schindlbeck等〔8〕研究表明，使用抗-CD176標志物，可提高腫瘤細胞檢出率。Deng等〔9〕介紹一種高靈敏度和穩定性的富集方法，它基于一個標志物抗角質蛋白(CK)或聯合抗CK和抗EpCAM兩個標志物。這個方法使用Ariol?system(Genetix USA)在玻璃載玻片上對CTCs自動成像采集、分析。

2.1.2 微流體技術 該方法的基本原理是在微流體裝置的微柱上固定特異性抗體(如EpCAM抗體)，通過控制流速和剪切力的大小，將血液中的腫瘤細胞從血液富集到微流體芯片上。分離規模上皮腫瘤細胞(ISET)系統是基于過濾以分離人的上皮腫瘤細胞，因為其尺寸比外周血白細胞大。熒光原位雜交是使用ISET對腫瘤細胞的染色體進行收集與分析，與基于聚合酶鏈反應(PCR)遺傳分析一樣，可應用ISET分離細胞〔10〕。

Lin等〔11〕發明了一種便攜式過濾器的微型裝置，既是一個檢測分析平臺，又能多路復用成像和遺傳分析，并有潛力使常規CTC分析有效管理臨床的癌癥患者。據報道，這個裝置是基于人類血細胞和CTC大小區別，在10 min能捕獲大約90%的CTC。他們還發展和驗證了一個新穎的三維微過濾裝置，可富集血液的CTC活細胞數。該設備在用于研究、臨床環境評估和描述濃縮CTC中提供了一個非常有價值的工具〔12〕。

已開發了通過使用抗體涂布微柱捕獲表達EpCAM的外周血細胞的一個被稱為CTC芯片的微流體裝置〔13〕。最近，同樣的組織已開發了一種高通量微流體混合裝置提供了一個增強的平臺分離CTC的人字形芯片〔14〕。通過使用一定數量的腫瘤細胞，對照血清來確認高效的細胞捕獲，在臨床實用程序已被前列腺癌患者的標本所證明。另一個新穎的微流體設備已被證明可以在很短時間內選擇性地和特異地分離極其少量的CTCs〔15〕。最近有發明利用表面增強拉曼光譜(SERS)，直接測量針對性的CTC出現的白細胞〔16〕。SERS納米粒子與表皮生長因子肽作為目標配位體已經成功地確定CTC患者的外周血液中。

2.2 CTC檢測系統

最近的CTC檢測和表征技術進步包括：(a)基于圖像的方法，如經典的免疫細胞化學(ICC)，美國食品和藥物管理局(FDA)批準的CellSearch?系統(Veridex)，Ariol系統，鐳射掃描細胞計數器;(b)分子學測定以核酸為基礎分析CTC，如高度敏感的RT-qPCR方法、RT-PCR檢測，或結合分子和成像方法;(c)蛋白質化驗，如EpiSpot測定，檢測CTC釋放的腫瘤特異性蛋白。檢測抗CK抗體是目前最確認和標準化的方法，它還允許從形態上解釋陽性事件。

這些方法的主要區別是檢測CTCs的方法不同。影像學方法是通過熒光標記的抗體主要是抗上皮細胞抗原例如CK-19征隔離的CTCs。因此，有限數量的其他蛋白質標記也被用于檢測。相反，分子學測定主要是根據基因表達分析CTCs。通過使用這種方法，可通過高度敏感的檢測上皮標記(例如CK-19)證明一個小數量的CTCs存在數百萬外周血單核細胞。分子學測定不能用于準確估計一個樣本呈現的CTC數量;然而，大量的分子標記(例如，基因表達，DNA突變)中可檢測到CTC，使利用CTC的分子特性可行。這些方法彼此互補，因為他們體現CTC不同的信息。

2.2.1 基于影像學的方法 檢測腫瘤細胞傳播利用經典的ICC技術，通常由訓練有素的病理學家通過視覺觀察彩色CK陽性的上皮CTCs，許多樣品分析可能耗費數個小時。Pachmann等〔17〕通過使用一個快速、定量自動微觀程序，允許多達10個篩選1 000倍濃縮的鐳射掃描細胞計數器已量化最小數量的腫瘤細胞。

美國FDA批準使用的CellSearch系統(Veridex)〔2〕是基于ICC和免疫熒光的組合，為CTC使用特定的標記，如CKs(主要是CK19);白細胞，如CD45;細胞活力，如二脒基苯基吲哚(DAPI)核染色陽性。CellSearch?系統檢測CTC已通過嚴格的臨床測試項目驗證。這種技術在乳腺癌中已產生了大量的CTC臨床預后的相關性數據。最近，Sieuwerts等〔18〕研究了由CellSearch確定定義的5個人乳腺癌細胞亞型的全球基因表達圖譜〔正常像、基底、人類表皮生長因子受體2(HER2)陽性，細胞腔的A和B〕。

Balic等〔19〕已開發出了一種多標記的圖像分析技術運用新奇的DyLight技術方法。這種成像方法是基于使用多重抗體〔也就是抗 CK、Her2/神經膜，乙醛脫氫酶1(ALDH1)、CD44、CD24〕標記不同顏色的熒光染料和光譜圖像分析分離不同顏色光譜。這個技術有助于檢測和描述表征浸潤性腫瘤細胞，用額外的標記可評估不同的亞種群表達的特定治療靶目標。

2.2.2 CTC的分子學測定檢測 分子學測定利用分析的極敏感、特異性的PCR來檢測和枚舉CTC。利用PCR檢測的優點是產量很高，容易執行。首先從CTCs分離的總RNA，隨后的RT-PCR擴增腫瘤和上皮的特定靶目標。重要的是，RT-qPCR檢測可設計在電子信息學中，這樣就很容易自動化，并受到內部和外部質量控制系統〔20〕。

鑒于大背景的循環細胞，它可能需要從超過106個白細胞中檢測到一個癌細胞。雖然RT-PCR的潛在敏感和特異性分析足以達到這一目的，但這將需要使用適當的mRNA標記。這種方法的唯一缺點是不能夠準確估計一個樣本的CTCs數量。一個主要優勢是其分子學方法的靈活性，特別是這些多路化驗減少了所需的樣本數量、時間和分析成本。

識別特定亞型的CTCs基于不同基因表達，這可提供有關腫瘤轉移和改善病人的臨床治療，這些方法用于確定CTC必須檢測所有腫瘤細胞類型。然而，事實上CTC非常少，可用的樣本數量非常有限，所以這是一個巨大的分析和技術挑戰〔21，22〕。Obermayr等〔23〕表明，在乳腺癌中用RT-qPCR檢測CTCs的一組6個基因優于EpCAM和乳腺珠蛋白(hMAM)，這些基因在子宮內膜、宮頸癌和卵巢癌癥中可能成為潛在的CTC檢測標志物。Reinholz等〔24〕表明，循環上皮細胞 SCGB2A2(mammaglobin)和B305D-C的分子特性提供了潛在的早期檢測浸潤性乳腺癌的可能。最近，Aktas等〔25〕使用商品試劑盒(AdnaTest Breast Cancer，AdnaGen AG)，檢測到 EpCAM、附膜蛋白(MUC)1 和HER2在CTC中的轉錄，在轉移性乳腺癌患者發現大量CTCs，表明它具有上皮到間充質過渡(EMT)和腫瘤干細胞的特征。有趣的是，當用RT-PCR檢測來評估在 CTC中雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達時，CTC傳播的主要發現是三陰腫瘤細胞，一般CTC發現大多是三陰，且與原發性腫瘤的ER、PR和HER2狀態無關〔26〕。幾個mRNA標記可用于基于 RTPCR的CTC檢測。幾個單獨標記提供足夠的靈敏度，但標志物組合產生提高CTC檢出率。在早期乳腺癌中通過使用一個多標記的 RT-PCR 檢測 CTC，Ignatiadis等〔27〕已表明 KRT19、SCGB2A2(乳腺珠蛋白)和ERBB2(HER-2)陽性與無病生存期較短相關。

Markou等〔28〕最近開發了一種多路復用PCR耦合的液珠陣列檢測多種基因在CTCs中的表達。使用這種方法，建立了6個 CTC基因靶目標〔ERBB2;SCGB2A2(乳腺珠蛋白);KRT19;黑色素瘤抗原的家族1(MAGEA1);TWIST-1和HMBS(也被稱作PBGD)〕，同時在一個非常有限的樣本中放大和檢測相同反應，從而節約寶貴的CTC樣本并減少成本和時間分析。研究了100個基因在CTC中的表達并形成一個有效的基礎、多路復用的方法。

2.2.3 上皮細胞免疫斑點(EPISPOT)測定 EPISPOT測定被開發來檢測CTC釋放的腫瘤特異性蛋白。根據這種分析的結果，有活性的上皮腫瘤細胞釋放全長的CK19，釋放CK19的細胞可能構成具有高轉移性的乳腺癌細胞的子問題〔29〕。

3 CTC在乳腺癌中的臨床應用

Cristofanilli等〔2〕研究提示在轉移性乳腺癌患者中，治療之前的CTC數量是一個獨立的預后指標。使用CellSearch系統檢測177例轉移性乳腺癌患者7.5 ml外周血中CTC數量，發現CTC數≥5個或者＜5個時，患者無進展生存期和總生存率有統計學差異，CTC數＞5個時，病人復發轉移的可能性增大。因此認為CTC數量可作為乳腺癌無進展生存率、總體生存率和判斷預后的獨立預測指標。Budd等〔30〕應用CellSearch系統，通過和影像學對比，評價CTC預測總體生存期的作用。結果表明CTC比影像學方法可更早、重復地預示疾病狀態，CTC水平和總體生存期有更好的相關性。Ntoulia等〔31〕多因素分析結果顯示Mammaglobin A-mRNA陽性細胞是一個獨立的危險因素，應用巢式RT-PCR法檢測101例可行手術的早期乳腺癌和39例轉移性乳腺癌患者外周血中Mammaglobin A-mRNA陽性細胞的表達。對照組檢出率為0，早期乳腺癌組13.9%，轉移性乳腺癌組17.9%。

CTC分子特性將提供重要的信息進行識別和理解治療靶點抗療法，進一步研究CTC分子特性將有助于更好地了解癌癥患者腫瘤細胞轉移性。CTC檢測可能成為一個有價值的方法來改善癌癥患者預后。

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A

1005-9202(2012)23-5347-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.137

吉林省衛生廳科研課題(No.2010Z086);吉林省自然科學基金項目(201215215)

1 東北師范大學生命科學院

鮑慧錚(1969-)，女，博士，主任醫師，主要從事淋巴血液腫瘤研究。

〔2012-03-11收稿 2012-07-05修回〕

(編輯 張 慧)