鹽酸右美托咪定預處理對缺血-再灌注損傷大鼠心肌Bax和Bcl-2表達的影響*

陳 盼,趙 明,蔣 鵬,王勝軍,谷騰飛

(江蘇省鎮江市江蘇大學附屬醫院麻醉科 212000)

鹽酸右美托咪定預處理對缺血-再灌注損傷大鼠心肌Bax和Bcl-2表達的影響*

陳 盼,趙 明△,蔣 鵬,王勝軍,谷騰飛

(江蘇省鎮江市江蘇大學附屬醫院麻醉科 212000)

目的研究鹽酸右美托咪定對大鼠心肌缺血-再灌注損傷時心肌凋亡相關基因Bax和Bcl-2表達的影響?方法 將21只健康SD大鼠隨機分為3組:假手術組(sham組,n=7)?缺血-再灌注組(I/R組,n=7)?缺血-再灌注+鹽酸右美托咪定組(DEX組,n=7)?采用結扎左冠狀動脈前降支的方法制備在體大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型?采用RT-PCR?免疫組化方法檢測Bcl-2和Bax mRNA?蛋白的表達,TUNEL法檢測凋亡細胞TTC染色測定心肌梗死面積?結果與sham組比較,I/R組Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表達增加(P0.05);與I/R組比較,DEX組Bcl-2mRNA和蛋白表達升高(P0.05),Bax mRNA和蛋白表達下降(P0.05),凋亡細胞明顯減少(P0.01),心肌梗死面積減小(P0.05)?結論鹽酸右美托咪定預處理可上調心肌缺血-再灌注損傷大鼠心肌Bcl-2mRNA和蛋白表達,下調Bax mRNA和蛋白表達,表明鹽酸右美托咪定在心肌缺血-再灌注損傷中有抗凋亡的作用?

心肌缺血;心肌再灌注損傷;細胞凋亡;基因,bcl-2;右美托咪定

心肌缺血-再灌注損傷(myocardium ischemia-reperfusion injury,MIRI)是心肺復蘇?心肌梗死溶栓和介入治療以及心臟移植中的重要病理生理過程[1]?大量基礎和臨床研究表明缺血?缺氧后的再灌注不僅可以導致細胞的壞死,也可以誘導細胞的凋亡,所以在缺血-再灌注損傷中,細胞凋亡是其眾多機制之一[2]?鹽酸右美托咪定是高選擇性α2-受體激動劑,其在鎮靜?鎮痛方面的研究已經有報道,但對其在缺血-再灌注損傷中的保護作用的報道卻不多?本研究通過建立大鼠在體心肌缺血-再灌注損傷模型,觀察鹽酸右美托咪定對大鼠心肌缺血-再灌注損傷后心肌組織中Bcl-2和Bax的表達,旨在探討鹽酸右美托咪定在心肌缺血-再灌注損傷中的抗凋亡作用及其可能的作用機制?

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鹽酸右美托咪定注射液200μg/2mL(江蘇恒瑞醫藥有限公司提供,批號:10110434)?Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀;Bcl-2?Bax和β-actin引物均由上海生工合成;逆轉錄試劑盒和RT-PCR試劑盒購于TAKARA公司;Trizol Reagent試劑盒購于Invitrogen公司;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體?兔抗鼠Bax單克隆抗體?TUNEL試劑盒均購于武漢博士德公司;2,3,5-氯化三苯基 四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)購自美國Sigma公司?

1.2 實驗動物分組與處理 健康3個月齡SD雄性大鼠21只,體質量250～300g,江蘇大學動物中心提供?隨機分成3組:假手術組(sham組,n=7)?缺血-再灌注組(I/R組,n=7)?

1.5 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件處理分析數據,所有計量數據均以±s表示?多樣本均數組間比較用單向方差分析(one-way ANOVA),多樣本均數間兩兩比較采用最小顯著差數法分析,兩組間差異檢驗采用t檢驗,P0.05示差異有統計學意義,P0.01提示差異有顯著統計學意義?

2 結 果

2.1 鹽酸右美托咪啶對大鼠心肌梗死面積的影響 由TTC染色結果可見sham組染色后心肌呈深紅色;I/R組和DEX組可見明顯的灰白色梗死灶,且DEX組的梗死面積明顯縮小,與I/R組比較,差異有統計學意義(P0.05)?見表1?

2.2 Bcl-2?Bax的 RT-PCR檢測 I/R組和 DEX組,與sham缺血-再灌注+鹽酸右美托咪定組(DEX組,n=7)?除sham組左冠狀動脈穿線不結扎,連續觀察105min外,其余兩組均結扎左冠狀動脈前降支缺血30min,再灌注60min,DEX組在結扎前30min經腹腔注射鹽酸右美托咪定注射液100μg/kg,sham組和I/R組在結扎前30min腹腔注入等量的生理鹽水?

1.3 大鼠心肌缺血-再灌注模型的建立 參照文獻[3-4]制備心肌缺血-再灌注損傷模型?

1.4 檢測方法與指標

1.4.1 心肌梗死面積測定 建模成功后,迅速取出心臟,用生理鹽水洗去血液,將左心室水平切成約2mm的薄片,置于37℃0.5%TTC磷酸緩沖液中染色15min,用以區分壞死區(灰白色)和非壞死區(深紅色)并稱質量,梗死面積以壞死區心肌質量占左室質量的百分比來表示?

1.4.2 Bcl-2和Bax的mRNA的檢測 將制備成功的模型動物斷頭處死,迅速取大鼠心肌缺血區域的組織,提取總RNA后,按照TAKARA試劑盒將總RNA逆轉成cDNA并保存于-20℃冰箱?應用SYBR Premix Ex Taq RT-PCR試劑盒,按照說明書以大鼠心肌組織的cDNA為模板在Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀上進行擴增及定量分析?設定β-actin為內參基因(正向引物:5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC,反向引物:5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC)?Bcl-2引物(正向:5′-TCCAAGCAAAACGTC-CAGA,反向:5′-TCCTTCCCCAGTTAATGATGC):94℃30s→94℃30s→60℃20s→72℃20s(35個循環)?Bax引物(正向:5′-AAAGTGCCCGAGCTGATC,反 向:5′-AGGACTCCAGCCACAAAGA):94 ℃ 30s→94℃30s→61℃20s→81℃20s(35個循環),擴增循環結束后,進行熔解曲線分析,用2-△ct△ct方法進行計算和統計?

1.4.3 免疫組化法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達 剪下缺血區心肌于10%甲醛固定24h,石蠟包埋切片,按試劑盒說明書用免疫組化法染色?光學顯微鏡下觀察,Bcl-2蛋白染色呈棕黃色顆粒,位于核膜或胞漿內;Bax蛋白染色呈棕黃色顆粒,位于細胞漿內?在每張載玻片上隨機選擇10個區域,免疫陽性細胞率=免疫細胞陽性數/(免疫細胞陽性數+免疫細胞陰性數)×100%?

1.4.4 TUNEL法檢測凋亡細胞 剪下缺血區心肌于10%甲醛中固定24h,石蠟包埋切片,按TUNEL試劑盒說明書進行標記染色?凋亡的細胞核染成棕黃色,未凋亡的細胞核為藍色?高倍鏡下每張切片隨機選取10個視野,計數凋亡心肌細胞數和心肌細胞總數,以凋亡指數反映各組心肌凋亡的情況,凋亡指數=視野內凋亡細胞個數/視野內所有心肌細胞個數×100%?組相比,Bcl-2mRNA表達增高(P0.05),Bax mRNA表達增高(P0.05);DEX組與I/R組比較,Bcl-2mRNA 表達增高(P0.05),Bax mRNA表達降低(P0.05),見圖1?2?

表1 大鼠心肌組織梗死范圍(±s,n=7)

表1 大鼠心肌組織梗死范圍(±s,n=7)

*:P0.05,與I/R組比較?

組別 n 心肌梗死面積(%)7 0 I/R組 7 29.86±0.75 DEX組 7 23.60±0.55 shame組*

圖1 大鼠心肌組織Bcl-2mRNA表達

圖2 大鼠心肌組織Bax mRNA表達

2.3 Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 I/R組和 DEX組,與sham組相比,Bcl-2蛋白表達增高(P0.05),Bax的蛋白表達增高(P0.05);DEX組與I/R組比較,Bcl-2的蛋白表達增高(P0.05),Bax的蛋白表達降低(P0.05),見表2?

表2 心肌組織Bcl-2?Bax蛋白表達和凋亡細胞陽性率(±s,n=7)

表2 心肌組織Bcl-2?Bax蛋白表達和凋亡細胞陽性率(±s,n=7)

*:P 0.01,與sham組比較;△:P0.05,與I/R組比較?

組別 Bcl-2(%) Bax(%) 凋亡指數Sham組10.1±0.40 11.57±0.53 3.14±0.40 I/R組 23.71±0.51* 49.28±1.19* 30.86±0.91*DEX組 33.29±0.75*△ 35.43±0.65*△ 19.71±0.75*△

2.4 I/R組大鼠缺血區心肌可見大量凋亡細胞 TUNEL法檢測細胞凋亡的結果,sham組大鼠缺血區心肌極少見凋亡細胞;DEX組比I/R組凋亡細胞明顯減少(P0.01),見封3圖3?

3 討 論

細胞凋亡是細胞主動的?通過基因嚴密調控的程序性死亡?Bcl-2即B細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因,通過其所編碼Bcl-2蛋白而發揮其抑制細胞凋亡的功能,它是一個多基因家族,Bcl-2和Bax蛋白是此家族的兩個主要成員,Bcl-2有抗凋亡的作用,而Bax則促凋亡?若Bcl-2表達增多,則形成Bcl-2/Bcl-2同源二聚體,也可形成Bcl-2/Bax異源二聚體,均起抑制細胞凋亡的作用?若Bax表達增多,形成Bax/Bax同源二聚體,則促進細胞凋亡發生?細胞凋亡是心肌缺血-再灌注損傷作用機制之一,其他包括炎癥反應?能量代謝障礙?鈣離子超載和活性氧的大量產生等[5-6]?

鹽酸右美托咪定為高選擇性α2-腎上腺素受體激動劑,具有鎮靜?鎮痛?抗交感和抑制血漿中的兒茶酚胺釋放作用,還有止涎?抗寒顫和利尿的作用[7]?α2-受體是去甲腎上腺素受體的一個亞型,廣泛分布在中樞神經系統內外,α2-受體有α2-A?α2-B和α2-C 3個亞型,這些受體調節各個系統的功能,如心血管系統?交感神經系統和血液系統等,中樞神經系統腦內α2-AR最密集的區域在腦的藍斑,而鹽酸右美托咪定已被證實的作用位點是藍斑[8]?Engelhard等[9]研究證明,鹽酸右美托咪定對大鼠大腦不全性缺血-再灌注有神經保護作用,可能是通過 Madm-2(murine double minute 2)抑制 P53的活性,下調Bax和上調Bcl-2表達,產生抗凋亡作用?Dahmani等[10]研究表明,在大鼠大腦缺血-再灌注損傷中,鹽酸右美托咪定通過激活α2-腎上腺素受體,減少腺苷酸環化酶激活,增加磷酸化的黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)含量,發揮神經保護作用?本研究結果表明,與sham 組比較,I/R組 Bcl-2?Bax的mRNA和蛋白表達量均增加,而DEX組與I/R組比較,Bcl-2 mRNA和蛋白表達量增加,Bax mRNA和蛋白表達量降低,凋亡細胞減少,而心肌梗死面積縮小與Okada等[11]的研究一致,表明鹽酸右美托咪定預處理可以減少心肌細胞凋亡,減少心肌梗死范圍,保護心肌組織?鹽酸右美托咪定在缺血-再灌注損傷過程中可促進Bcl-2mRNA和蛋白的表達,抑制Bax mRNA及蛋白的表達,可能是通過α2-腎上腺素受體-腺苷酸環化酶通道,增加磷酸化的FAK含量,再介導FAK-Ras-MAPK通路和FAS-PI3K通路,上調Bcl-2表達的同時下調Bax的表達,發揮抗凋亡作用,保護缺血-再灌注的心肌細胞;有研究表明鹽酸右美托咪定可降低大腦缺血的大鼠血漿中的兒茶酚胺的濃度[12],產生神經保護作用?因此,鹽酸右美托咪定也可能通過激動交感神經末梢的突觸前α2-受體興奮,降低循環中的去甲腎上腺素的釋放并降低血漿中的兒茶酚胺的濃度,減少細胞內Ca2+內流?

本研究初步認為,鹽酸右美托咪定能抑制心肌缺血-再灌注損傷時心肌細胞凋亡的發生,保護心肌細胞,但更多保護機制有待在今后的研究中進一步證實?

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Effects of dexmedetomidine on myocardial expression of Bax and Bcl-2 in rat myocardial ischemia/reperfusion injury*

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(,,,212000,)

ObjectiveTo investigate the effect of dexmedetomidine on the expression of Bcl-2and apoptosis related protein Bax in rat myocardium apoptosis during ischemia reperfusion.Methods21healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3groups:sham group,I/R group(I/R group)and IR+dexmedetomidine group(DEX group).Ligation of left anterior descending coronary artery was performed for establishing the rat myocardial ischemia/reperfusion injury mode in vivo.Real-time and immunohistochemistry were used to analyze the expression of Bcl-2and Bax at mRNA and protein leves,TUNEL was used to analyze apoptoic index and TTC staining was adopted to investigate the infract size.ResultsCompared with the sham group,the expression of Bcl-2at mRNA and protein level were increased in the I/R group(P0.05),the expression of Bax at mRNA and protein level was significantly increased in the I/R group(P0.05).Compared with the I/R group,the expression of Bcl-2at mRNA and protein level was heightenend(P0.05)in the DEX group,Bax at mRNA and protein level was decreased in the DEX group(P0.01).The infract size and apoptotic index were reduced compared with the IR group.ConclusionDexmedetomidine can inhibit the apoptosis of myocardium by up-regulating the expression of Bcl-2and down-regulating the expression of Bax at mRNA and protein level,which may be part of the molecular mechanism of dexmedetomidine on myocardial preservation.

myocardial ischemia;myocardial reperfusion injury;apoptosis;gene,bcl-2;dexmedetomidine

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.016

A

1671-8348(2012)16-1604-03

* 基金項目:江蘇省鎮江市科技支撐-社會發展項目(SH2010014);江蘇大學臨床醫學科技發展基金(jly2010136)?△

,Tel:13952852326;E-mail:lightzhao168@163.com?

2011-10-14

2011-12-09)

?衛生管理?