培美曲塞對SKP2蛋白表達的影響及意義

萬 琴,王順金

(南昌大學附屬第二醫院腫瘤科,江西南昌 330006)

培美曲塞對SKP2蛋白表達的影響及意義

萬 琴,王順金△

(南昌大學附屬第二醫院腫瘤科,江西南昌 330006)

目的探討S期激酶相關蛋白2(SKP2)在培美曲塞(PMX)處理后肺腺癌細胞A549中表達的改變及意義?方法根據PMX的濃度設1個對照組和4個實驗組,分別為:0μmol/L組(A 組)?0.01μmol/L組(B組)?0.1μmol/L組(C組)?1μmol/L組(D組)?10μmol/L組(E組),采用甲基噻唑基四唑(MTT)法檢測A549細胞的增殖;利用流式細胞技術分析A549細胞周期的分布;通過Western blot法檢測A549細胞SKP2蛋白表達?結果PMX明顯抑制A549細胞增殖,以10μmol/L?72h作用抑制率最高(P0.01);與A組相比C?D?E組S期細胞顯著增多(P0.05);各組SKP2蛋白相對表達水平差異有統計學意義(P0.01);與對照組相比,實驗組SKP2蛋白相對表達水平顯著增加(P0.01)?結論PMX能明顯抑制A549細胞增殖且將其阻滯于S期,PMX處理后的A549細胞中SKP2蛋白表達上調,這可能影響PMX對肺腺癌的化療療效?

肺腫瘤;細胞周期;S期激酶相關蛋白質類;培美曲塞

S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)是SCF泛素連接酶復合體(Skp1-Cullin-1-F-box)的特異性底物識別亞單位,大量研究已證實SKP2基因是一種潛在的癌基因,主要存在于惡變細胞的S期,許多腫瘤細胞高表達或普遍表達SKP2蛋白?SKP2的表達與非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)的發生?發展密切相關[1],并且是NSCLC的一個獨立的預后指標[2-3]?SKP2表達下調很可能有利于阻止腫瘤增長,被認為是NSCLC分子水平的一個新治療靶點?培美曲塞(pemetrexed,PMX)是一種新的多靶點葉酸抑制劑,通過抑制葉酸依賴性酶,干擾胸腺嘧啶和嘌呤的合成,達到抗腫瘤的目的?PMX因有效?低毒等優點在NSCLC一線和二線治療中的地位已經確立,并在維持治療中顯著延長患者總生存期,有關PMX的研究已經成為腫瘤學界的一個熱點?Wu等[4]研究發現PMX處理后A549細胞中P27表達上調,且在0～10μmol/L范圍內,具有濃度依賴性?SKP2能介導P27多聚泛素化蛋白水解,有關PMX對SKP2蛋白表達的影響國內外尚未見報道?為此,本組檢測了PMX對A549細胞周期及SKP2蛋白表達的影響,以探討SKP2在PMX處理后的A549細胞中表達的改變及意義?

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞株:人肺腺癌細胞系A549細胞由南昌大學第二附屬醫院分子醫學中心保存?(2)主要試劑:PMX(江蘇豪森,批號061101,含量102.2%)?DMEM 培養基?胰蛋白酶(北京Solarbio公司)?胎牛血清(美國Hyclone公司)?二甲基亞砜(美國Ameresco公司)?蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)?四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT;上海普飛生物技術有限公司)?酶標儀(芬蘭Lab systems公司)?流式細胞儀(BD公司)?SKP2抗體(Santa Cruz公司)?山羊抗兔IgG抗體(中杉金橋公司)?免疫印跡配膠?電泳?電轉裝置(Bio-Rad公司)?

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞用DMEM培養基(含10%胎牛血清?100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素),在5%CO2?37℃的條件下常規培養傳代?

1.2.2 MTT檢測PMX對A549細胞的抑制率 取對數生長期細胞,制成細胞懸液,按每孔5×103/200μL,接種于3塊96孔培養板中,24h后加入PMX,濃度分別為:0?0.01?0.1?1?10μmol/L?3塊板分別作用24?48?72h后加20μL濃度為5g/L的 MTT,37℃?5%CO2條件下孵育4h,吸出培養液,加二甲基亞砜150μL/孔,避光條件下置于水平搖床上搖10min,

1.3 統計學處理 用SPSS17.0軟件進行數據分析,計量資料用±s表示,行單因素方差分析?檢驗水準α=0.05?使MTT晶體溶解,經酶標儀490nm波長檢測光密度值(optical density,OD)?按以下公式計算各組抑制率(inhibition rate,IR):抑制率IR(%)=(對照組OD均值-實驗組OD均值)/對照組OD均值×100%?實驗重復3次?

1.2.3 流式細胞周期技術 將細胞接種于6孔板,貼壁后加不同濃度PMX,24h后收集細胞,制成單細胞懸液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗2次,離心,棄上清液,加PBS重懸細胞,加-20℃預冷的75%乙醇并振蕩,4℃固定1h,離心,棄冰乙醇,PBS沖洗,棄上清液,加入含碘化吡啶和無DNA酶污染的PBS染色液,4℃避光靜置1h,使用流式細胞檢測儀檢測G1?S?G2各期細胞所占的百分率?重復3次?

1.2.4 Western blot法檢測SKP2的表達 收集處于對數生長期的A549細胞,根據細胞計數結果加入含10%胎牛血清的完全培養基,調整細胞濃度為5×105個/mL,接種于培養瓶,貼壁后加入不同濃度PMX,放入5%CO2孵箱中孵育48h后收集細胞,PBS洗滌2次,提取總蛋白,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度?取等量蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電濕轉法將凝膠上蛋白轉至聚偏氟乙烯膜上?5%脫脂奶粉室溫封閉2h?一抗孵育4℃過夜?二抗室溫孵育2h,暗室曝光?重復3次?

2 結 果

2.1 MTT比色法檢測PMX對A549細胞增殖的抑制情況見表1?由表1可見,PMX對A549細胞具有抑制作用,同一時間不同濃度PMX組之間的細胞增殖抑制率以10μM濃度組最高,同一濃度組分別作用24h?48h?72h后,以72h抑制率最高?

表1 不同濃度PMX對A549細胞增殖的抑制率(±s,%,n=3)

表1 不同濃度PMX對A549細胞增殖的抑制率(±s,%,n=3)

*:P 0.01,與同時間組比較;#:P 0.01,與同濃度組比較?

PMX(μmol/L)24h 48h 72h 0.01 7.19±3.31 10.93±7.31 21.88±10.23 0.1 17.07±7.89 18.53±7.33 27.39±7.66 1 28.03±7.39* 29.62±10.47* 44.34±7.04*10 58.63±0.86* 68.24±4.29*# 78.61±3.66*#

2.2 PMX使A549細胞周期阻滯在S期 不同濃度(0.01?0.1?1?10μM)的PMX處理A549細胞48h后,細胞周期被阻滯于S期?見表2?封4圖1?

表2 流式細胞儀檢測細胞周期分布的結果(±s,%,n=3)

表2 流式細胞儀檢測細胞周期分布的結果(±s,%,n=3)

*:P0.05,#:P 0.01,與同周期0μmol/L組比較?

細胞周期 0μmol/L 0.01μmol/L 0.1μmol/L 1μmol/L 10μmol/L 75 54.31±2.54 S 17.39±4.21 21.57±3.53 26.95±4.71* 34.76±3.85# 42.47±2.96#G2 5.39±3.69 10.09±7.88 9.33±2.44 5.88±3.91 3.G1 77.22±3.64 68.34±10.71 63.72±6.86 59.36±4.22±1.85

2.3 PMX處理A549細胞后SKP2蛋白表達升高 以目標蛋白灰度值與β-actin蛋白灰度值之比表示蛋白相對表達水平,各組的蛋白相對表達水平分別為:A組0.38±0.03?B組0.79±0.02?C組0.84±0.02?D組0.80±0.05?E組0.96±0.03,差異有統計學意義(P0.01);與 A組相比,B?C?D?E組蛋白相對表達水平顯著增加(P0.01)?PMX處理后SKP2蛋白表達升高,且在一定的濃度范圍內,表達量隨著PMX濃度的增加蛋白表達量也增加?見封4圖2?

3 討 論

SKP2位于人類第5號染色體短臂上(5p13),主要存在于惡變細胞的S期,能特異性地識別磷酸化的細胞周期蛋白(cyclin)如:p27kip1?p130?p21wafl?p53?E2F?cyclin D1?cyclin E?cyclin A?cyclin B等依賴性激酶抑制劑,并參與這些蛋白的降解,導致細胞周期抑制物減少,細胞過度增殖,促進惡性腫瘤的發生?發展?SKP2在許多腫瘤細胞中高表達或普遍表達,在高表達的腫瘤中,通過下調SKP2的表達可能抑制腫瘤的增長[5]?Kudo等[6]將SKP2siRNA質粒轉染于口腔鱗癌細胞后發現,SKP2沉默會導致P27kip1表達的增加,抑制口腔鱗癌細胞的增殖?同樣,Lee與 McCormick[7]通過干擾惡性腦膠質瘤細胞株T98G中SKP2的表達可以促進T98G凋亡,推斷SKP2可作為癌基因治療的一個靶點?SKP2在NSCLC中也普遍表達,并在NSCLC的發生?發展中起重要作用,下調SKP2會導致 NSCLC細胞的凋亡[8]?Jiang等[9]將SKP2-siR-NAs轉染于3株肺癌細胞株后SKP2蛋白表達降低,P27蛋白表達升高,其中肺腺癌細胞A549細胞轉染SKP2-siRNAs后,細胞增殖率降低12%,凋亡率升高36%?因而,本組認為剔除SKP2基因的過度拷貝或抑制SKP2蛋白的表達,將成為治療惡性腫瘤的一條新路徑?

PMX是一種新的多靶點葉酸抑制劑,通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合酶?二氫葉酸還原酶和甘氨酰胺核苷酸轉甲基酶,影響DNA和RNA的合成,使細胞停滯于S期,從而促進腫瘤細胞的凋亡達到抗腫瘤的作用?在NSCLC中,PMX主要用于治療局部晚期或轉移性NSCLC(不包括大多數的鱗狀細胞癌),它對肺腺癌及大細胞癌的療效遠遠優于鱗狀細胞癌?因此,本研究選用PMX敏感的肺腺癌細胞A549細胞為實驗對象,通過MTT證實PMX對A549細胞具有明顯抑制作用,且在一定濃度范圍內,抑制作用隨著濃度增加而增強,以10μmol/L的抑制作用最明顯?通過流式細胞周期技術分析發現,PMX主要使A549細胞阻滯于S期,這與 Wouters等[10]的文獻報道相符?

本研究旨在探討NSCLC治療中常用新藥PMX對SKP2蛋白表達的影響及意義,以了解PMX是否能通過對SKP2的下調進一步促進腫瘤細胞的抑制?本實驗通過Wes tern blot法表明PMX處理后的A549細胞中SKP2表達并未下調,相反,實驗組SKP2蛋白表達量明顯高于對照組,且隨著藥物濃度的增加,其表達量也增加?SKP2表達上調可能促進腫瘤細胞的增殖,然而MTT法顯示PMX對A549細胞具有明顯的抑制作用,本組推斷雖然PMX處理后細胞SKP2表達升高,但是SKP2的升高引起的細胞增殖不足以抵抗PMX對肺腺癌細胞的抑制作用,所以總體表現為抑制?SKP2表達的增加是PMX直接作用的結果還是對細胞周期調節后的表現,其具體機制還不清楚,需要作進一步研究?再者,SKP2是癌基因,SKP2蛋白表達上調是否與PMX治療的療效及預后有關目前尚不知曉,這必須引起重視并進行更深入的研究?

SKP2也是一個重要的預后評價指標,SKP2在卵巢癌?軟組織肉瘤?口腔鱗癌?胃癌和直腸癌中的表達與預后相關都見諸報道?人們發現SKP2高表達患者預后差,SKP2的表達就像N分期一樣是總生存率的一個獨立預測指標?Osoegawa等[11]通過多因素分析顯示SKP2是NSCLC的一個獨立預后因子,SKP2高表達的NSCLC患者預后不良?SKP2是否是PMX治療肺腺癌的一個預后指標也有待進一步的研究?

總之,本實驗再次肯定了PMX對肺腺癌細胞的抑制作用以及S期阻滯;本研究發現PMX處理后肺腺癌細胞A549細胞中SKP2蛋白表達升高,其具體機制目前尚不清楚,但SKP2是癌基因,其表達上調可能影響PMX的化療療效及預后?同時,進一步探討PMX與特異性下調SKP2表達的藥物聯用后療效是否會增加將為今后臨床更好地使用PMX以及提高肺腺癌患者的化療療效提供重要的理論基礎?

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Impact of Pemetrexed on expression of SKP2 in adenocarcinoma of lung cell lines A549 cellandits significance

,
(,,,, 330006,)

ObjectiveTo investigate the expression variation and significance of s-phase kinase-associated protein 2(SKP2)in lung adenocarcinoma A549cells after the treatment of Pemetrexed(PMX).MethodsOn the basis of the concentration of PMX,we set one control group and four experimental groups:0μM(group A),0.01μM(group B),0.1μM(group C),1μM(group D),10μM(group E).The growth of A549was tested by MTT assay.The effect of PMX on the cell cycle phase distribution of A549was analyzed by flow cytometry.The expression of SKP2protein of A549cells was detected by Western blot.ResultsMTT assay showed that PMX could significantly inhibit the growth of A549cells,and the highest inhibitory rate was(78.61±3.66)%at the concentration of 10μM when A549cells were cultured for 72h(P0.01).Meanwhile,S-phase cells in the group C,D and E was more than those in the group A(P0.05,P0.01,P0.01).The difference of SKP protein expression among various groups was significant(P0.01),and compared with the control group,SKP2protein expression was significantly increased in the experimental groups(P0.01).ConclusionPMX could inhibit the growth of A549cells and arrest them in S-phase.The expression of SKP2 protein in PMX-treated A549cells is upregulated,which might influence the chemotherapy effect of PMX.

lung neoplasms;cell cycle;S-phase kinase-associated proteins;pemertrexed

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.020

A

1671-8348(2012)16-1614-03

△通訊作者,Tel:13970018719;E-mail:wangshunjin1950@163.com?

2011-11-08

2011-12-22)

?臨床研究?