鼻咽癌組織中微淋巴管和微血管密度的觀察及其臨床意義*

陳 闖,譚曉虹,岑 洪,李必迅,陳 軍

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院,南寧 530027)

鼻咽癌組織中微淋巴管和微血管密度的觀察及其臨床意義*

陳 闖,譚曉虹△,岑 洪,李必迅,陳 軍

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院,南寧 530027)

目的觀察鼻咽癌組織中以D2-40標記的微淋巴管和以CD34標記的微血管的密度及其臨床意義?方法 對106例初治鼻咽癌的組織標本,用免疫組化的方法及計算機輔助的圖像分析系統定量分析腫瘤組織中淋巴管密度(LVD)及微血管密度(MVD)與臨床資料的關系,同時分析LVD與MVD之間的關系?結果106例標本淋巴管和微血管染色均呈陽性?LVD與N分期?復發及轉移相關(P0.05),而與年齡?性別?T分期?臨床分期無關(P0.05)?MVD與T分期?臨床分期?復發及轉移相關(P0.05),與年齡?性別?N分期無關(P0.05)?CD34的表達與D2-40的表達呈正相關?結論LVD是鼻咽癌頸淋巴結轉移的重要因素,LVD?MVD均與鼻咽癌復發及遠處轉移密切相關?

鼻咽癌;淋巴管;微血管;免疫組織化學

中國是鼻咽癌高發區,據世界衛生組織(WHO)國際癌癥研究機構的資料,在全球統計的年鼻咽癌新發病例64 796例中,中國達28 022例,占43.2%?目前早期(Ⅰ+Ⅱ期)鼻咽癌5年生存率為60%～100%,晚期(Ⅲ+Ⅳ期)鼻咽癌5年生存率為10%～40%,主要死因為局部未控制和遠處轉移,大量研究證實,實體腫瘤的侵襲與轉移依賴于新生血管生成,腫瘤的血管生成與其生長?分期及預后有密切關系,抗血管的靶向治療已成為一種有效的治療手段?由于缺乏淋巴內皮標記物,所以對腫瘤轉移的另一通道——淋巴系統的研究卻相對較少?近年來一系列淋巴管特異標記物(如podoplanin?prox-1?LYVE-1及D2-40)的相繼出現,使淋巴管生成與腫瘤轉移及預后關系的研究成為繼腫瘤血管生成之后的新的研究熱點?本組通過研究分別以D2-40和CD34標記的106例鼻咽癌組織微淋巴管?微血管的表達情況,探討兩者與鼻咽癌臨床資料的關系,尋求有效指標來預測鼻咽癌患者復發?轉移風險及預后,為臨床放?化療和靶向治療提供參考?同時分析淋巴管密度(lymph vessel density,LVD)與微血管密度(micro-vessel den-sity,MVD)的關系,初步探討抗鼻咽癌淋巴管生成治療和抗血管生成治療是否具有同樣的價值?

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2002～2003年間在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院初治的鼻咽癌患者(男78例,女28例;年齡17～72歲,中位年齡47歲)的臨床資料及瘤體活檢組織標本?全部有病理診斷,原發灶T110例,T267例,T313例,T416例,頸部淋巴結轉移包括:N020例,N141例,N225例,N320例?

1.2 實驗儀器及試劑 顯微鏡(B×40型)為Olympus公司產品?Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統購自北京麥克奧迪圖像技術有限公司?第一抗體:鼠抗人CD34單克隆抗體,購自Neomakers公司?鼠抗人D2-40單克隆抗體,購自Zymed公司?第二抗體:兔抗PV-6001?鼠抗PV-6002,均購自北京中杉公司?3,3′-二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)溶液?二步法免疫組化 MaxVisionTM試劑盒:酶標聚合物,購于福州邁新公司?

1.3 方法 本實驗所有患者組織切片均應用免疫組化兩步法進行CD34?D2-40蛋白檢測?陽性對照:用已知的CD34?D2-40陽性切片作對照?陰性對照:用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照?

1.4 結果判斷和分組標準 LVD和 MVD計算結果的判定均參照 El-Gohary等[1]及 Weidner[2]的方法?D2-40陽性染色定位于淋巴管內皮細胞胞膜和細胞質,呈棕黃色顆粒狀?D2-40染色以陽性著色的單個內皮細胞或內皮細胞簇分別計為一個陽性微淋巴管,先在40倍光鏡下確定3個著色密集的區域,200倍光鏡下分別計數3個視野,取其平均值?血管內皮細胞胞漿呈棕黃色或棕褐色者為FⅧRAg陽性細胞?凡在腫瘤組織中,分界清楚的陽性染色的血管內皮細胞或血管內皮細胞簇只要結構不相連,其分枝結構也作為一個血管計數?管腔大于8個紅細胞或已形成明顯肌層的血管不參與計數?具體方法是低倍鏡(40×)下選取高血管密度區,在200×視野下計數3個視野的MVD,取其平均值作為該例腫瘤的MVD值?

1.5 統計學處理 用SPSS13.0軟件處理數據,計量資料用±s表示,進行兩獨立樣本t檢驗?LVD?MVD相互關系用直線相關方法作相關分析?Kaplan-Meier法及Log-rank法行生存率分析和檢驗?P0.05表示差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 鼻咽癌組織中LVD與臨床資料的關系 分析LVD與腫瘤臨床資料的關系顯示,無淋巴結轉移(N0)組?無復發?轉移組LVD值均較有頸淋巴結轉移(N1+N2+N3)組?復發+轉移組低,差異有統計學意義(P0.05)?以臨床Ⅰ/Ⅱ期(早期)和Ⅲ/Ⅳ期(晚期)以及以T1+T2(局部早期)和Tv3+T4(局部晚期)各分兩組,LVD值Ⅲ/Ⅳ期?T3+T4期均高于Ⅰ/Ⅱ期?T1+T2期,P值分別為0.320?0.637,差異均無統計學意義?按年齡中位數(47歲)分兩組,≥47歲組和47歲組,按性別分男女兩組,其LVD值均較接近,差異無統計學意義(P0.05),見表1?

表1 LVD與臨床資料的關系(±s)

表1 LVD與臨床資料的關系(±s)

臨床參數 n LVD(D2-40)P性別男28 14.89±5.16 0.091年齡(歲)≥47 54 16.85±5.85 0～47 52 15.51±4.47 0.189 T分期T1～T2 77 15.29±5.08 T3～T4 29 15.84±5.96 0.637臨床分期Ⅰ～Ⅱ 41 14.96±5.11Ⅲ～Ⅳ 65 16.02±5.62 0.320 N分期N0 20 13.01±3.95 N1～N3 86 15.89±5.67 0.034復發?轉移有27 16.49±5.26無78 16.29±5.39女79 14.16±4.86 0.038

2.2 鼻咽癌組織中MVD與臨床資料的關系 分析微血管密度與腫瘤臨床資料的關系顯示,臨床早期組(Ⅰ+Ⅱ)?局部早期組(T1+T2)?無復發轉移組 MVD值均分別較臨床晚期組(Ⅲ+Ⅳ)?局部晚期組(T3+T4)?復發+轉移組低,P值分別為0.005?0.042?0.035,差異均有統計學意義?無淋巴結轉移(N0)組 MVD值比有頸淋巴結轉移組(N1+N2+N3)低,差異無統計學意義(P=0.605)?按年齡(以年齡中位數為界)?性別各分兩組,其 MVD值差異均無統計學意義(P0.05),見表2?

表2 MVD與臨床資料的關系(±s)

表2 MVD與臨床資料的關系(±s)

臨床參數 n MVD(D34)P性別男28 52.39±28.25 0.357年齡(歲)≥47 54 55.61±30.56 0～47 52 58.63±36.58 0.645 T分期T1～T2 77 47.51±35.17 T3～T4 29 63.51±36.77 0.042臨床分期Ⅰ～Ⅱ 41 45.63±21.08Ⅲ～Ⅳ 65 64.10±37.48 0.005 N分期N0 20 52.05±33.10 N1～N3 86 56.09±30.96 0.605復發?轉移有27 67.71±40.13無78 59.17±34.89女79 50.91±33.48 0.035

2.3 LVD與MVD的關系 對微淋巴管和微血管密度行相關分析,P值為0.015(r=0.613)?相關分析結果表明腫瘤組織中LVD與MVD呈正相關?

3 討 論

腫瘤的侵襲和轉移是癌癥患者死亡的重要原因之一,也是影響患者生存期和治療效果的主要原因?血道和淋巴道是癌細胞遠處轉移的主要途徑?血道的轉移依賴腫瘤微血管的生成,MVD直接反映腫瘤微血管數量,與諸多病理參數?臨床參數有密切關系?近來,淋巴管內皮特異性因子的不斷發現,如D2-40?LVYF-1?PROX-1等,使腫瘤淋巴管生成與腫瘤轉移及預后關系的研究成為繼腫瘤血管生成之后新的研究熱點?

CD34和D2-40是目前標記腫瘤微血管和微淋巴管最常用的標記物?CD34抗體是目前檢驗微血管構筑的較好方法,有較強的可重復性?經過組織超微結構和其他淋巴管標記物證實,單克隆抗體D2-40只存在于淋巴管內皮細胞上?此抗體對淋巴內皮具有很強的特異性和敏感性[3]?

本研究發現CD34?D2-40在106例鼻咽癌組織均有表達?MVD值比LVD大?LVD在有頸部淋巴結轉移(N1+N2+N3)?有復發或轉移的患者明顯高于無頸部淋巴結腫大(N0)?無復發或轉移的患者?而LVD值在年齡?性別?T分期?臨床分期各組中差異無統計學意義(P0.05)?MVD在鼻咽部原發灶偏晚期(T3+T4)?臨床中晚期(Ⅲ+Ⅳ)?有復發+轉移患者的表達明顯高于鼻咽部原發灶偏早期(T1+T2)?臨床早期(Ⅰ+Ⅱ)?無復發或轉移的患者?而 MVD在年齡?性別?N分期各組中差異無統計學意義(P0.05)?因此,本組認為LVD與N分期(頸淋巴結轉移)及復發轉移相關(P0.05),與年齡?性別?T分期及臨床分期無關(P0.05)?MVD與T分期?復發轉移?臨床分期有關(P0.05),與年齡?性別?N分期(頸淋巴結轉移)無關(P0.05)?MVD?LVD均與復發轉移相關,無頸淋巴結轉移組和無復發轉移組LVD明顯低于有淋巴結轉移+復發轉移組,無復發轉移組MVD明顯低于復發+轉移組,均提示腫瘤淋巴管數量和微血管數量的多少與淋巴結轉移和腫瘤侵襲行為密切相關?T分期越晚,表明鼻咽癌的原發灶就越大或向周圍浸潤范圍越大?實體腫瘤的生長不僅取決于腫瘤細胞的種植效率和增生速度,還取決于腫瘤新生血管的形成[4]?本研究發現鼻咽癌 MVD與T分期相關,LVD與T分期無關?推測腫瘤原發灶的生長主要依賴微血管生成為主,有待進一步研究?

關于MVD?LVD與惡性腫瘤分期的關系研究中,各學者研究結果并非完全一致?劉宜敏等[5]研究表明MVD的水平均和鼻咽癌的分期密切相關,T?N?TNM分期越晚 MVD越高?李菊蘭等[6]研究表明 MVD與腫瘤分期有正相關關系?王勝資等[7]研究認為鼻咽癌D2-40的表達與N分期密切相關,而與年齡?T分期及臨床分期無關,CD34的表達與年齡?T分期及臨床分期相關?Beasley等[8]對70例頭頸部腫瘤進行研究后發現,在口咽癌中腫瘤內新生淋巴管數與頸部淋巴結轉移相關,而在其他的腫瘤中兩者無相關性,提示腫瘤淋巴管新生與淋巴結轉移的關系是復雜的?究其原因,除了各學者觀察例數差異或各期例數分布不均導致結果有一定的偏差外,由于腫瘤淋巴管和血管分布不均,呈明顯異質性,這就增加了尋找LVD?MVD“熱點”區域的困難?為此,亟待探索一種更客觀?更準確?更實用和標準化的腫瘤LVD?MVD計數評估方法?

近年來,對乳腺癌?胃癌?食管癌?大腸癌?胰腺癌[9]?膽囊癌[10]及胃腸間質瘤[11]的研究證實,MVD是一個獨立而重要的預后因素,高MVD提示腫瘤易發生轉移?預后不良?而腫瘤新生淋巴管的形成有利于腫瘤生長,還可促進腫瘤細胞沿淋巴管擴散轉移[12]?Schneider等[13]的研究亦表明,惡性腫瘤主要通過腫瘤邊緣毛細淋巴管進入淋巴系統,從而造成淋巴轉移?Isaka等[14]認為腫瘤周圍間質中淋巴管密度的增加和淋巴結轉移及惡性侵襲行為相關?有國外學者報道LVD和MVD與腫瘤患者的不良預后密切相關[15-16]?另有報道LVD越高,預后越差[17]?Matsumoto等[18]采用同樣方法標記食管癌和結直腸癌的新生微淋巴管,發現LVD高的患者遠期生存率更短,提示LVD為惡性腫瘤遠期預后的獨立預測指標?鼻咽癌組織中淋巴管與預后關系的研究目前尚不多?國內有人研究了55例鼻咽癌患者VEGF-C?VEGFR-3表達和LVD與復發及預后的關系,發現 VEGF-C?VEGFR-3高表達及高LVD的患者預后較差[19]?目前鼻咽癌的治療以放射治療為主,早期(Ⅰ+Ⅱ)鼻咽癌5年生存率為60%～100%,晚期(Ⅲ+Ⅳ)鼻咽癌5年生存率為10%～40%,主要死亡原因為局部未控制和遠處轉移?對Ⅲ+Ⅳ患者,單獨放療遠期效果不十分理想?對這部分患者同期的放?化療可提高5年生存率?鼻咽癌雖然是對放?化療敏感的腫瘤,但仍有部分在首程治療后出現復發?遠處轉移,因而尋找可以監測鼻咽癌治療后復發?遠處轉移的指標對臨床治療有重要意義?通過上述研究,作者認為LVD?MVD可作為預測鼻咽癌轉移和復發指標之一,它們有助于預測鼻咽癌的復發轉移,在臨床中對高LVD?MVD的患者,應加強治療或密切隨訪?對這部分患者除了應用同期放?化療外,可能還要加用輔助化療或者給予抗血管或淋巴管生成抑制劑以防止遠處轉移或復發,提高遠期療效?

本研究發現LVD?MVD均與鼻咽癌轉移?復發相關,提示這兩個指標可能有一定的相關性且具有臨床意義?國內有研究表明腫瘤組織中淋巴管新生和血管新生相伴隨且對腫瘤生長?轉移及預后有所影響[20]?本研究通過相關分析發現106例鼻咽癌腫瘤組織中的淋巴管和微血管相關系數r=0.613,P0.05),表達傾向呈一致性?雖然目前以腫瘤血管為靶點的抗血管生成治療在臨床中應用,取得了較好的療效,但并未完全阻斷腫瘤的生長,提示仍應探索更多新的抗腫瘤生長的靶點?Roberts等[21]比較了控制腫瘤轉移方面抗血管生成和抗淋巴管生成的作用,證實將淋巴管作為靶點不僅可以預防腫瘤轉移,而且在腫瘤轉移后的治療中也具有重要的意義?因此,作者認為阻斷鼻咽癌淋巴管生成的靶向治療可能和抑制腫瘤內血管增生具有相同的臨床意義,或者同時阻斷腫瘤血管生成和淋巴管生成可能會進一步提高療效,值得深入研究?

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Observation and significance of lymph vessel density and micro-vessel density in nasopharyngeal carcinoma*

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(,,, 530027,)

ObjectiveTo assess the expression and significance of lymph vessel(LVD)density marker with D2-40and microvessel density(MVD)marked with D34in nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods106NPC patiens pathologically proved and treated in our hospital were included.Immunostaining for the lymphatic marker D2-40and for the vascularendothelial marker CD34 were used in same NPC specinen.Computer-assisted morphometric analysis was used.The lymph vessels and blood vessels were quantified within the tumor area in all patients in the same specinen.ResultsBoth lymph vessels and blood vessels within the tumor were found.A significant correlation was found between the expression of lymph vessels and N stage,recurrence and metastasis(P0.05).No significant correlation was found between the lymph vessel parameters and age,gender,T stage and clinical stage(P0.05).There was a significant correlation between the blood vessel parameters and T stage,clinical stage,recurrence and metastasis(P0.05).No significant correlation was found between the blood vessel parameters and age,gender,N stage(P0.05).The expression of D2-40had positive correlation with the expression of D34.ConclusionLVD is the factors of neck lymph node metastasis.Both LVD and MVD are related with recurrence and metastasis of NPC.

nasopharyngeal neoplasms;lymphatic vessels;microvascular;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.008

A

1671-8348(2012)16-1582-03

* 基金項目:廣西科學基金資助項目(桂科自0991230)?△

,E-mail:tanxhong@163.com?

2011-10-28

2011-12-20)

?基礎研究?