細胞穿透肽BDNF融合蛋白研究進展

魯吉珂，楊艷坤，司艷紅，關方霞

(鄭州大學生物工程系 河南 鄭州 450001)

帕金森病(Parkinson’s Diease，PD)是中老年人常見的中樞神經系統慢性退行性疾病，其發生與黑質紋狀體中多巴胺含量減少有關。腦源性神經營養因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)屬神經營養素(Neurotrophin)家族成員，能夠促進多種神經元的存活，尤其對多巴胺能神經元有很強的營養和保護作用，并參與PD的發病與病理進程，被認為是治療PD的新一代藥物［1］。但因為BDNF為大分子物質，不能透過血腦屏障，腦室內用藥又極其不方便，給臨床的應用帶來很大困難。

蛋白轉導域家族是自然界中天然存在的一類多肽，能夠安全高效地實現多種外源生物大分子的跨膜轉導［2］。構建轉導肽與BDNF融合蛋白，可實現BDNF跨膜運輸并達到對神經系統退行性疾病的治療目的，國內外文獻報道較多。本文從細胞穿透肽和BDNF融合蛋白的國內外研究方面展開綜述，旨在為開發基于BDNF融合蛋白相關藥物研究提供參考。

1 細胞穿透肽

細胞穿透肽(Cell penetrating peptide，CPP)，又稱蛋白轉導域(Protein tansduction domain，PTD)，是一類具有跨膜轉導能力的小分子肽段，能以非能量、非受體依賴性的方式把生物大分子跨膜轉導入各種細胞內［3］。目前已發現的細胞穿透肽主要包括人類免疫缺陷病毒1型(Human imunodeficiency virus type 1，HIV-1)編碼的反式轉錄激活因子TAT、果蠅同源異型轉錄因子ANTP、單純皰疹病毒1型(HSV-1)轉錄因子VP22和人工合成的多聚精氨酸及多聚賴氨酸等［2］。

CPP一般分為3類:蛋白轉導域PTD，模型多肽和設計多肽。PTD是來源于特定天然蛋白片段具有蛋白轉導功能的肽段，如TAT;模型多肽是模仿已知結構CPPs的氨基酸序列，如多精氨酸;設計多肽是根據特定需要設計不同來源多肽片段［4］。不同來源的CPP并沒有相似的氨基酸序列，其共同點是為正電荷或兩性分子［4］。滿足實際應用的CPP分子應當滿足下列條件:①小分子，易于合成;②易于和多種分子結合，不改變其轉導性能;③對組織、細胞具有較高的選擇性;④穩定性好，毒性及副作用小［4］。

CPP及其結合的生物大分子的轉導是目前研究的熱點，截至2012年3月13日，Pubmed中題目或摘要中含有CPP的文獻有523篇，研究較多集中在TAT和ANTP上，見表1。據法國學者 Vivès在2008年的報道，關于TAT和ANTP的文獻占CPP的文獻75%以上［5］。值得注意的是，作為一種藥物運輸體系，CPP分子的毒性必須要考慮。目前體外毒性研究較多，而活體毒性報道相對較少。盡管尚未發現CPP的毒性和不良反應，但英國學者Bolton等報道稱當10μg或者更高劑量的跨膜肽注射大鼠時，可檢測到腦細胞炎癥和神經細胞死亡現象，而劑量降低到1 μg時，上述效應大大降低［6］。

表1 Pubmed數據庫相關文獻檢索結果

2 腦源性神經營養因子(BDNF)

BDNF是1982年德國神經生物學家Barde等從豬腦中分離出來的小分子蛋白質，廣泛分布于中樞神經系統。BDNF不僅對神經元的發育、增殖分化、存活起重要作用，而且對神經元損傷后的再生修復與功能重塑也起了重要作用［7，8］。因此，BDNF 在神經系統疾病如PD的治療上有重要的應用前景。但應用BDNF治療神經系統疾病時，主要存在2個問題。一是人BDNF天然含量極低，每千克組織僅可提取得到微克水平的BDNF，目前尚未找到豐富的組織來源［9］;另一方面，由于存在血腦屏障，BDNF無法進入大腦發揮生物活性，限制了其應用。腦內直接注射BDNF需反復給藥、易造成顱內感染，直接應用攜帶BDNF基因的質粒存在表達不足，而腺病毒又存在安全隱患問題［10］。

通過基因工程手段來制備高純度BDNF，成本較低，有望解決BDNF來源問題。結合細胞穿透肽跨膜轉導技術，采用基因工程方法表達并純化得到BDNFPTD融合蛋白，將具有治療作用的BDNF透過血腦屏障而發揮生物效能，有望解決BDNF給藥問題。關于BDNF-PTD融合蛋白研究，國內文獻較多，如裴明軍等［8］構建含PTD與 BDNF融合基因的質粒，并在大腸肝菌中表達，PCR擴增PTD-BDNF融合基因，經DNA測序無誤后插入表達質粒pJW2構建質粒pJPB，轉化大腸桿菌并進行PTD-BDNF蛋白的誘導表達和純化。石秦東等［8］構建以增強型綠色熒光蛋白(EGFP)為報告基因的BDNF融合蛋白真核表達質粒，并對其表達和定位進行研究［11］。英文期刊中關于BDNF融合蛋白文獻相對較少，Zhou等［12］將人BDNF與PTD融合表達后，并重點對融合蛋白PTD-BDNF對小鼠腦損傷的保護作用進行研究。關于BDNF的文獻總結見表2。但總的來說，目前關于BDNF的文獻仍處于實驗室研究階段，臨床應用的報道非常少。

表2 關于BDNF融合蛋白相關文獻總結

3 融合蛋白表達載體構建

目前融合蛋白表達載體研究集中在原核表達載體，如pET系列，pTAT等。這些表達載體部分為直接商品化產品，部分為研究者自行構建。真核表達載體研究相對較少，此外，還有一部分化學合成的融合蛋白。原核表達簡單快捷，表達量大，有多種載體和菌種可供選擇，可以多個基因一起表達，技術也較為成熟，但其缺點是無法對蛋白進行翻譯后的修飾，一些來源于高級生物的蛋白在原核系統中無法正常折疊，以包涵體的形式存在，需要復雜的蛋白復性過程;真核表達載體具有轉錄后加工功能，產物以可溶活性蛋白形式存在，提取純化成本較低，但其表達量相對較低，周期較長，載體價格也較貴［15］。

化學交聯的融合蛋白其結構便于控制，有利于研究其結構與膜穿透機理。另外，化學交聯法可制備多種結構的新型CPP融合蛋白，如含有非基因編碼氨基酸D-氨基酸的融合蛋白，但該方法目前研究較少［16］。關于融合蛋白相關表達載體構建的文獻總結見表3。

4 細胞靶向穿膜肽

CPP能夠轉導各種生物大分子進入各類細胞，但因缺乏細胞特異性，有可能對正常組織和細胞造成毒害作用。通過細胞靶向肽(Cell-targeting peptides)，可提高多肽的細胞特異性。因此將靶向載體與CPP結合起來，尋求具有靶向作用的CPP并構建融合蛋白，可結合兩者優點，實現靶向和跨膜兩種功能，是未來研究的一個方向［5］。李海玉等［34］成功構建了基于細胞穿透肽的蛋白表達運輸載體pET14b-HC(L)NE(pET14b-His-CPP-Linker-NLS-EGFP)，蛋白轉導實驗顯示得到融合蛋白可快速穿透細胞膜并進入細胞核;該蛋白表達載體具有細胞穿透肽靶向細胞核運輸的作用。吳向玲等［35］將能夠靶向誘導腫瘤細胞凋亡的凋亡素VP3，構建到內化活性得到提高的改良型穿透肽載體上，構建pET14b-VP3-EGFP-TAT表達載體，得到了具有促凋亡活性的融合蛋白。

5 小結及展望

目前關于CPP的研究主要集中在以下3個方面:①研究CPP結構，揭示其跨膜原因，進而研究發現新的具有蛋白轉導功能的CPP，并提高其跨膜轉導能力。如 Eiríksdóttir等［33］對10種常用 CPP 分子的二級結構進行比較進行研究，考察了CPP對磷脂膜的作用，并據此對CPP分子進行重新分類;②CPP跨膜機理研究，該部分研究文獻較多，但尚未有統一的結論;③拓展CPP在生物大分子物質跨膜運輸中的應用［23，30］。

綜上所述，細胞穿透肽是一種有力的跨膜工具，將其與靶向肽結合起來，構建具有靶向作用的CPP-BDNF融合蛋白，有助于BDNF透過血腦屏障，直接靶向運送到中樞神經系統內，從而為PD治療提供新思路。

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