不同酵母發(fā)酵對葡萄酒香氣成分的影響

李雙石，李浡，吳志明，王曉杰，蘇寧

（1.北京電子科技職業(yè)學院，北京100029；2.中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北昌黎066600）

葡萄酒釀造是一個復雜的微生物學過程，其中酵母菌是葡萄酒發(fā)酵工業(yè)中占主導地位的微生物。葡萄酒的釀造就是在酵母菌的作用下，采用自然發(fā)酵或者純種發(fā)酵，將葡萄原料中各種潛在質量在酒中充分表現(xiàn)出來。在酒精發(fā)酵過程中，酵母菌在將糖轉化為酒精和二氧化碳的同時，還產(chǎn)生很多副產(chǎn)物，它們直接影響到葡萄酒的口感和風味，決定了酒品質的優(yōu)劣[1]。葡萄酒香氣是衡量葡萄酒質量的重要指標，它們對葡萄酒的產(chǎn)地風格和典型性均起決定性的作用。葡萄酒的香氣物質根據(jù)來源分類，可分為三大類，即葡萄漿果香氣、發(fā)酵香氣和陳釀香氣，葡萄酒總體芳香成分的大部分是由發(fā)酵香氣組成的[2]。前期研究表明，葡萄酒中含有多種香氣物質，目前已經(jīng)報道的有1 300 多種，主要包括醇類、酯類、酸類、醛類、酮類、萜烯類等，其中，超過400 種的成分是由酵母發(fā)酵產(chǎn)生的[3]。

國內對葡萄酒中香氣成分研究報道較多，但關于酵母對葡萄酒香氣的影響報道較少。本研究采用自然發(fā)酵、本土優(yōu)選釀酒酵母菌株Y14 接種發(fā)酵、國外商業(yè)葡萄酒活性干酵母F15 接種發(fā)酵分別進行葡萄酒釀造實驗，并利用頂空固相微萃取（HS-SPME）和氣相色譜與質譜聯(lián)用技術（GC-MS）分析葡萄酒中的香氣成分，研究不同酵母對葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分的影響，旨在為釀酒工藝實施提供理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：本土釀酒酵母菌株Y14 分離自釀酒葡萄的自然發(fā)酵液；對照釀酒酵母F15 是進口葡萄酒商業(yè)活性干酵母Zymaflora F15：法國拉曼公司。

供試葡萄原料：2011年10月市售成熟的巨峰葡萄（Kyoho）。

主要儀器設備：Agilent6890A 氣相色譜儀和Agilent 5975B 質譜儀聯(lián)用（購自美國Agilent 公司）；固相微萃取裝置和PDMS/CAR/DVB 固相微萃取頭（50/30 μm）（購自美國Supelco 公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄酒發(fā)酵實驗

用2～4 層經(jīng)滅菌的紗布將新鮮、成熟的葡萄原料包起來，在無菌條件下用手擠壓，將300 mL 葡萄汁置于無菌三角瓶中，并將殘余的葡萄皮及葡萄籽也加入瓶內。在葡萄汁中加入亞硫酸至SO2有效含量達到60 mg/L，混合均勻，用封口膜密封。然后依不同的處理方法不接種酵母或接種活化好的酵母，25 ℃靜置發(fā)酵，每日分3 次稱量發(fā)酵液重量，至發(fā)酵液重量不變時即為發(fā)酵終止。酒精發(fā)酵結束后，對葡萄酒樣進行取樣，低溫保存，待進一步成分分析。

3 種不同的酵母接種處理有：不接種純種酵母，即自然發(fā)酵；本土優(yōu)選釀酒酵母菌株Y14 活化后，依3%接種量接種；進口商業(yè)活性干酵母F15 依產(chǎn)品說明書活化接種。

1.2.2 葡萄酒樣香氣成分提取

頂空固相微萃取方法：將不同處理的葡萄酒樣用0.45 μm 膜過濾，吸取5 mL 待測葡萄酒樣品加入至15 mL 的頂空微萃取樣品瓶中，同時放入1 g NaCl 和磁力轉子，迅速用樣品蓋擰緊后置于恒溫磁力攪拌加熱平臺上。將已活化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，萃取頭距離液面1 cm。于40 ℃下吸附30 min，吸附后的萃取頭插入氣相色譜進樣口，于250 ℃熱解析8 min。

1.2.3 葡萄酒樣香氣成分分析

GC-MS 分析：DB-FFAP 毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min；手動進樣，進樣量1 μL，采用不分流模式；柱溫箱升溫程序為：40 ℃保持5 min，再以10 ℃/min 的速度升溫至240 ℃，保持2 min。質譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式EI，離子能量70 ev，質量掃描范圍為20 u～350 u。

香氣物質定性定量分析：利用質譜全離子掃描圖譜，依據(jù)已有標樣的色譜保留時間和質譜信息、NIST05 標準譜庫比對結果對葡萄酒中的香氣物質進行定性分析。采用氣相色譜峰面積歸一化法確定各香氣組分的相對含量。

2 結果與討論

2.1 不同酵母發(fā)酵葡萄酒樣香氣成分分析

不同酵母發(fā)酵的葡萄酒樣中共檢測出揮發(fā)性香氣成分81 種，表1 列出了60 種主要成分，其中含醇類30 種、酯類20 種、酸類10 種。

葡萄酒自然發(fā)酵就是利用葡萄果皮表面或空氣中的天然野生酵母進行發(fā)酵的過程。自然發(fā)酵過程是一個復雜的酵母菌群消長和更替的過程，有大量的酵母菌種參與。由表1 可見，自然發(fā)酵的葡萄酒樣中香氣成分最復雜，共檢測出53 種香氣成分，由此可見多種酵母菌種的參與有助于增加葡萄酒中香氣物質組成的復雜性。自然發(fā)酵酒樣中主要的香氣成分有異戊醇（33.11%）、苯乙醇（8.63%）、三甲基硅醇（2.52%）、三氟乙酸基油醇（2.46%）、異丁醇（2.45%）、棕櫚酸乙酯（2.30%）和辛酸（2.25%）。

目前葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中大量使用商用葡萄酒活性干酵母，優(yōu)良的葡萄酒活性干酵母能使性能優(yōu)良的釀酒酵母在整個葡萄酒釀造過程中占優(yōu)勢，能確保葡萄酒發(fā)酵過程的穩(wěn)定和葡萄酒質量的穩(wěn)定。本研究采用國外商業(yè)活性干酵母F15 接種發(fā)酵，此葡萄酒樣中共檢測出47 種香氣成分，主要的香氣成分為乙酸乙酯（19.91%）、異戊醇（14.44%）、醋酸（12.75%）、苯乙醇（10.47%）和異丁醇（2.90%）。

表1 不同釀酒酵母菌株發(fā)酵葡萄酒中香氣物質的含量Table 1 Volatile aroma components of wines fermented by different yeast strains

續(xù)表1 不同釀酒酵母菌株發(fā)酵葡萄酒中香氣物質的含量Continue table 1 Volatile aroma components of wines fermented by different yeast strains

由于國內的葡萄酒廠主要靠引入國外活性干酵母進行葡萄酒生產(chǎn)，葡萄酒產(chǎn)品出現(xiàn)了同質化的缺陷，因此，性能優(yōu)良本土葡萄酒酵母菌株的開發(fā)和利用成為當今葡萄酒研究領域的熱點[4]。本研究采用的本土優(yōu)篩酵母Y14 發(fā)酵的葡萄酒樣中共檢測出39 種香氣成分，主要的香氣成分為異戊醇（20.97%）、乙酸乙酯（13.10%）、苯乙醇（11.66%）、醋酸（9.46%）、三甲基硅醇（3.71%）、乙酸苯乙酯（2.28%）和異丁醇（2.20%）。

2.2 不同酵母發(fā)酵葡萄酒樣香氣成分比較

2.2.1 醇類組分比較

葡萄酒中的醇類物質是構成葡萄酒發(fā)酵香氣的主要物質，它們主要是酵母酒精發(fā)酵過程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物。適量的醇能給葡萄酒帶來良好香氣，它們可使葡萄酒的香氣更為復雜、濃郁；但多數(shù)醇類具有不愉快的香氣，可能對葡萄酒的香氣質量產(chǎn)生負向貢獻[2，5]。由表1 可以看出，醇類物質是所有發(fā)酵酒樣香氣組成的主體成分。所有葡萄酒樣中共檢測出30種醇類物質，但共有成分僅有6 種。

在不同酒樣中含量最高的醇類物質均為異戊醇，其中自然發(fā)酵酒樣中此組分含量最高為33.11%，其次是本土菌株Y14 發(fā)酵酒樣為20.97%，F(xiàn)15 發(fā)酵酒樣中此組分含量最低，僅為14.44%。異戊醇則具有青草或香蕉的香氣，可使葡萄酒具有白蘭地的香型。在不同酒樣中含量位居第二的醇類物質都是苯乙醇，此組分在單一菌種發(fā)酵酒樣中含量較高，分別為11.66%（Y14）和10.47%（F15），而在自然發(fā)酵酒樣中含量僅為8.63%，由此可見，此物質可能主要是釀酒酵母的代謝產(chǎn)物。苯乙醇可賦予葡萄酒愉快的玫瑰香、紫蘿蘭香、茉莉花香等多種風味。在不同酒樣中含量較高的醇類物質還有三甲基硅醇、異丁醇和正己醇。在自然發(fā)酵和本土優(yōu)選釀酒酵母Y14 的發(fā)酵酒樣中，三甲基硅醇的含量僅次于異戊醇和苯乙醇，分別占全部香氣成分的2.52%和3.71%，而在商業(yè)酵母F15 發(fā)酵酒樣中的含量僅為1.67%，可見此物質可能是本地酵母發(fā)酵的特征性香氣成分。國外商業(yè)酵母F15 發(fā)酵酒樣中含量位居第三的醇類物質則為異丁醇，它占全部香氣成分的2.90%。

從醇類物質的種類區(qū)別來看，商業(yè)活性干酵母F15 接種發(fā)酵的葡萄酒樣中含有最多種類的醇類物質，高達17 種，其中特有香氣成分有10 種；自然發(fā)酵酒樣和本土釀酒酵母Y14 接種發(fā)酵的酒樣中均含有醇類物質13 種，其中分別含有特有香氣成分6 種和7種。從醇類物質的含量區(qū)別來看，自然發(fā)酵酒樣中醇類物質的含量最高，高達53.43%；其次是Y14 接種發(fā)酵酒樣，占41.45%；F15 接種發(fā)酵酒樣中醇類物質含量最低，只占34.75%。

2.2.2 酯類組分比較

大多數(shù)酯類物質具有鮮花或水果的香氣，有益于葡萄酒的香氣質量。影響葡萄酒中酯類組成和含量的主要因素是葡萄汁的化學組成和所采用的釀造工藝，當以上因素確定時，所選用的酵母菌株對葡萄酒中酯類組成影響就顯得至關重要了[6]。本研究中，不同酵母發(fā)酵的葡萄酒樣中共檢測出酯類物質20 種，但共有的酯類組分僅有3 種，它們是乙酸乙酯、乙酸異戊酯和棕櫚酸乙酯。

在F15 和Y14 接種發(fā)酵酒樣中含量最高的酯類成分是乙酸乙酯，此成分含量分別占香氣總含量的19.91%和13.10%，乙酸乙酯具有果香和奶油味，而在自然發(fā)酵酒樣中此組分的含量僅為1.83%。在自然發(fā)酵酒樣中含量最高的酯類成分是棕櫚酸乙酯（2.30%），此物質具有蘋果和菠蘿香氣。乙酸異戊酯在自然發(fā)酵酒樣中含量較高（1.13%），而在單一菌種接種發(fā)酵酒樣中的含量均較低，分別為0.42 %（F15）和0.26 %（Y14），乙酸異戊酯具有較強的新鮮果香，可賦予葡萄酒香蕉、梨、蘋果的酸甜味。有兩種酯類組分（乙酸苯乙酯、辛乙烯二醇正十二烷基酯）僅存在于本地酵母發(fā)酵的葡萄酒樣中，它們可能是本土酵母發(fā)酵生成的特征性香氣成分，其中乙酸苯乙酯在Y14 接種發(fā)酵的酒樣中含量高達2.28%，乙酸苯乙酯可賦予葡萄酒花香。乳酸乙酯僅存在于兩種單一菌種接種發(fā)酵酒樣中，乳酸乙酯具有水果和奶油香氣，可見此物質可能主要是釀酒酵母的代謝產(chǎn)物。

從酯類物質的種類差異來看，自然發(fā)酵酒樣中含有最多種類的酯類物質，高達14 種，而在F15 和Y14接種發(fā)酵的酒樣中分別只含有酯類物質8 種和7 種。不同發(fā)酵酒樣中所含酯類物質種類區(qū)別較大，自然發(fā)酵酒樣中獨有的香氣成分有9 種，F(xiàn)15 接種發(fā)酵酒樣中獨有的香氣成分有4 種，Y14 接種發(fā)酵酒樣中獨有的香氣成分有1 種。從酯類物質的含量差異來看，F(xiàn)15接種發(fā)酵酒樣中醇類含量最高，占全部香氣成分的24.88%；其次是Y14 接種發(fā)酵酒樣，占19.40%；在自然發(fā)酵酒樣中醇類物質含量只占12.33%。

2.2.3 酸類

有機酸是保持果酒中酒體平衡和口感清爽特性的主要物質，如適宜的含酸量能使葡萄酒帶有新鮮的水果香，能修飾葡萄酒的滋味和口感，并且有利于形成瓶貯酒香[7]。酸類物質的組成和含量同樣受到所選用酵母菌株的影響[8]。

由表1 可知，不同酵母發(fā)酵的葡萄酒樣中共檢測出10 種酸類物質，但共有酸類組分僅有2 種，為醋酸和辛酸。F15 和Y14 接種發(fā)酵酒樣中酸類物質的含量較高，分別占全部香氣成分的14.90%和12.99%，且含量最高的酸類物質均為醋酸。自然發(fā)酵酒樣中酸類物質含量較低，僅占全部香氣成分的5.01%，且以辛酸為主。

從酸類物質的種類差異來看，自然發(fā)酵、F15 接種發(fā)酵和Y14 接種發(fā)酵的酒樣中分別含有酸類物質6種、7 種和5 種，但種類區(qū)別較大，自然發(fā)酵酒樣中獨有的香氣成分有2 種，F(xiàn)15 和Y14 接種發(fā)酵酒樣中獨有的香氣成分均只有1 種。

3 結論

采用頂空固相微萃取（HS-SPME）和氣相色譜與質譜聯(lián)用技術（GC-MS）分析不同酵母發(fā)酵葡萄酒中的香氣成分，結果表明，不同的酵母發(fā)酵對葡萄酒中香氣成分的種類和含量均有較大影響。從不同酵母發(fā)酵的葡萄酒樣檢測到的60 種主要香氣成分中僅有11種共有成分，其中僅有3 種共有的主要香氣成分，它們分別是異戊醇、苯乙醇和異丁醇。自然發(fā)酵的葡萄酒樣中香氣成分最復雜，醇類物質含量最高；商業(yè)葡萄酒活性干酵母F15 產(chǎn)酯和產(chǎn)酸能力均最強；本土優(yōu)篩釀酒酵母菌株Y14 的產(chǎn)醇、產(chǎn)酯和產(chǎn)酸能力均為中等水平。

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