豬O型口蹄疫病毒溫度敏感突變株部分基因的PCR擴增及序列分析

劉 航，楊曉燕，侯相民，田永強

（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染偶蹄類動物后引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。家畜中牛、豬、山羊、綿羊等均為易感動物[2]。FMDV屬于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，主要有 7 個血清型，分別為：A、C、O、SAT1、SAT2、SAT3以及AsiaI型，每個血清型又包含若干個亞型。FMDV血清型眾多，傳染性極強，給世界多個國家造成了嚴重的經(jīng)濟損失，嚴重影響了世界畜牧業(yè)的發(fā)展[3]。FMDV基因組由包含大約8 500個核苷酸的單股線狀RNA組成?？谔阋逷1編碼區(qū)決定著病毒的抗原性和血清型，是研究分子流行病學(xué)、毒株演化關(guān)系和基因工程疫苗的基礎(chǔ)[4-6]。筆者根據(jù)O型FMDV全基因組序列設(shè)計了5對針對目的基因的引物，通過PCR擴增得到目的基因。對豬O型FMDV的強弱毒株基因進行克隆與序列分析，以期進一步擴充我國口蹄疫病毒毒株基因資料庫，為口蹄疫防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 豬O型口蹄疫病毒和IB-RS-2系傳代細胞，為蘭州獸醫(yī)研究所傳染病室分離凍存；感受態(tài)細胞JM109以及表達載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司。

1.1.2 試 劑 培養(yǎng)細胞的溶液10×DMEN、三抗、10×EDTA、7.5%NaHCO3、Taq Polymerase、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor、Oligo（dT）18、質(zhì)粒小提試劑盒以及膠回收試劑盒等均為大連寶生物公司產(chǎn)品。RNA提取試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。其他常規(guī)試劑均為實驗室分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 IB-RS-2系傳代細胞的復(fù)蘇與病毒傳代將實驗室凍存的IB-RS-2系傳代細胞從液氮中取出，并于38℃水浴中快速融化。用75%酒精消毒細胞管，然后用新鮮配制的細胞培養(yǎng)液（含20%犢牛血清）將細胞釋成約2×105個/mL，并于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)3～5代后，用不含血清的培養(yǎng)液清洗細胞2次，然后加入1 mL豬O型口蹄疫溫度敏感株病毒液，放置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。1 h后再加入不含血清的新鮮培養(yǎng)液，放入26℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)觀察。待細胞明顯發(fā)生CPE時，收集細胞并于-70℃冰箱凍存。將收集的病變細胞反復(fù)凍融3次后，吸取1mL再次感染新的IB-RS-2系細胞。以同樣的方法傳毒3代后，收集細胞提取病毒總RNA。

1.2.2 FMDV總RNA的提取及cDNA的擴增RNA的提取方法按照TRIzol LS Reagent試劑盒（Invitrogen）操作說明書進行。病毒RNA提取方法按照QIAGEN公司的RNA提取試劑盒操作說明書進行。然后以提取的RNA為模板，Oligo（dT）18為引物，利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。擴增體系為 ：5 ×Reverse Transcriptase Buffer 5 μL，10 mM dNTP Mixture 3 μL，5 U/μL AMV Rrverse Transcriptase XL 2 μL ，40 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，RNA 12 μL ，N2 primer 1 μL，Oligo dT 引物 1 μL，42℃保溫 1 h。

1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)FMDV全基因組序列，設(shè)計了 5 對針對 L 區(qū)、P1、P2、P3（3C、3D）區(qū)基因片段的引物（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.4 基因的克隆 以合成的O型口蹄疫cDNA為模板，進行PCR擴增：95℃預(yù)變性5 min；94℃ 變性 1 min，55℃復(fù)性 45 s，72℃延伸 1 min，共 30 個循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后連接至pMD18-T載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞JM109內(nèi)，挑斑并提取重組質(zhì)粒進行初步PCR鑒定，將初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生物工程有限公司進行測序鑒定，并將測序結(jié)果用生物軟件DNASTAR進行拼接。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的傳代

將實驗室凍存的豬O型FMDV溫度敏感株感染IB-RS-2系細胞3代后，用顯微鏡觀察正常細胞與病毒感染后細胞的形態(tài)。觀察結(jié)果如圖1所示，正常的IB-RS-2系傳代細胞的形態(tài)是細胞致密，形態(tài)小而且清晰透亮；接毒的IB-RS-2系傳代細胞的形態(tài)是細胞脫落，形態(tài)不清，細胞顆粒較多且細胞之間出現(xiàn)較大的間隙。

2.2 目的基因的擴增

將病變的IB-RS-2細胞裂解后，提取病毒總RNA，并通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄出cDNA。以合成的引物進行PCR擴增，成功擴增出了與預(yù)計長度相符合的目的產(chǎn)物。擴增結(jié)果如圖2所示，L、P1、P2、P3（3C、3D）區(qū)基因擴增出的目的條帶大小分別為603、2 208、1 464、639、1 410 bp，均與預(yù)期的擴增目的片段大小相符。

2.3 目的基因的測序與序列比對

將擴增的目的基因用膠回收試劑盒純化回收后連接到pMD18-T載體上，送上海生工進行測序。將獲得的測序結(jié)果拼接后與野生型豬O型FMDV序列進行比對，兩者的同源性為88%。

將O型溫度敏感株FMDV序列與O型緬甸98FMDV毒株序列進行比對及分析，從O型口蹄疫病毒溫度敏感株感染293M細胞的結(jié)果來看，其對細胞的毒力明顯下降，并且其侵染細胞的最適溫度降為26℃，不再是37℃。以O(shè)型口蹄疫病毒緬甸98毒株基因序列作為參考，與溫度敏感株基因序列進行比對，結(jié)果如下：兩者L區(qū)基因的堿基錯配率占L基因全長的12%，錯配堿基分布均勻，無明顯規(guī)律，L基因編碼的蛋白是FMDV毒力強弱的重要因子，因此推測L區(qū)基因的突變是導(dǎo)致溫度敏感株毒力下降的主要原因；P1區(qū)是FMDV的蛋白外殼編碼區(qū)，其堿基錯配率較低，F(xiàn)MDV保守區(qū)域的堿基都沒有發(fā)生突變；P2區(qū)堿基錯配率最低；P3區(qū)堿基錯配率較高，但主要集中在3A和3B部分，3D區(qū)堿基非常保守。從各部分編碼蛋白功能來看，3D為RNA依賴的RNA聚合酶，能夠催化病毒RNA的合成，對于病毒的自我復(fù)制非常重要，因此其堿基序列非常保守，而3A、3B區(qū)與病毒侵染宿主的能力有關(guān)。

3 討論

筆者將實驗室凍存的豬O型口蹄疫病毒溫度敏感突變株在IB-RS-2系傳代細胞（豬腎的異倍體細胞）中傳毒5代后提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到了cDNA，并根據(jù)GenBank中提交的FMDV基因序列設(shè)計各區(qū)段基因引物，通過PCR擴增得到了與預(yù)期相符的O型口蹄疫病毒溫度敏感株的L、P1、P2和P3區(qū)目的基因片段。測序及序列比對結(jié)果表明，獲得的各區(qū)序列拼接后與野生型豬O型FMDV序列兩者同源性為88%，而O型口蹄疫病毒溫度敏感株毒力下降及溫度敏感的原因可能是其L基因和P3區(qū)部分基因堿基突變所致，具體突變部分還有待進一步研究。

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