隆回縣食用百合鱗莖腐爛病菌生物學特性及室內防治藥劑篩選

朱海燕，夏 花，高必達,2,3

（1.湖南農業大學生物安全科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.植物疾病控制與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.植物病蟲害生物與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

2011年在邵陽隆回地區龍牙百合基地發現生長期百合鱗莖腐爛病，受害鱗莖變褐腐爛，其病原經鑒定確認為尖孢鐮刀菌百合專化型（Fusarium oxysporum f.sp.lilii）[1]。該病對百合生產造成重大影響，大田發病率達40%～60%[2]。為進一步了解該病菌病原特性，尋求最適防治方法，對該菌生物學特性進行了研究，并對防治藥劑進行了篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病原菌為隆回縣科技局提供的發病鱗莖上分離得到的尖孢鐮刀菌百合專化型。供試藥劑有75%百菌清可濕性粉劑（陜西先農生物科技有限公司），99%惡霉靈原藥（山東煙臺鑫潤精細化工有限公司），5%己唑醇微乳劑（東莞市瑞德豐生物科技有限公司），10%苯醚甲環唑水分散粒劑（山東澳得利化工有限公司），50%代森錳鋅可濕性粉劑（先正達作物保護有限公司），50%福美雙可濕性粉劑（石家莊市綠豐化工有限公司），50%烯酰嗎啉水分散粒劑（鄭州先利達化工有限公司），嘧菌酯懸浮劑（山東禾木藥業有限公司），3%中生菌素可濕性粉劑（深圳諾普信農業股份有限公司），12.5%烯唑醇可濕性粉劑（惠州市中訊化工有限公司），70%丙森鋅可濕性粉劑（深圳諾普信農業股份有限公司），72%甲霜靈—錳鋅可濕性粉劑（江蘇高郵市豐田農業有限公司），200 g/kg腈菌·福美雙（1∶9）可濕性粉劑（威海韓孚生化藥業有限公司）

1.2 試驗方法

1.2.1 溫度對菌絲生長和產孢的影響 設置10、13、16、19、22、25、28、31、34、37 和 40℃ 共 11 個不同溫度，將菌絲塊接于PDA平板中央，分別置于預設溫度的恒溫箱中培養，5 d后測量菌落直徑，7 d后測產孢量。

1.2.2 pH值對菌絲生長和產孢的影響 （1）pH值對菌絲生長的影響。用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配 制 pH 值 分 別 為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的 PDA 培養基，每個處理 4次重復；將直徑為7 mm的菌餅接種于不同pH值的培養液中央，于25℃下恒溫培養。5 d后，菌落長滿全皿時，將菌落移出來，用濾紙吸干后稱量鮮重，再烘干（65℃、24 h）稱干重，根據不同pH條件下增加的重量來比較其菌絲生長速率。（2）pH值對菌落產孢的影響。配制 pH 值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0 的 PDA 培養基，將 7 mm菌絲塊接種于平板中央，置于25℃恒溫培養箱中，7 d之后測定產孢量。

1.2.3 不同光照條件對病原菌產孢及菌絲生長的影響 將7 mm的菌絲塊移入150 mL液體查氏培養基中，設置連續光照、12 h光暗交替、完全黑暗3種不同光照處理，在27℃、200 r/min條件下培養5 d。每處理吸取1 mL菌懸液用無菌水稀釋10倍，在顯微鏡下用血球計數板測定產孢量；每處理再量取140 mL培養液用定量濾紙過濾孢子，用相同大小的濾紙作對照，80℃恒溫烘干至恒重，分別稱量干重，并計算菌絲量。

1.2.4 分生孢子致死溫度的測定 吸取1.2.3中光暗交替處理的菌懸液9 mL，過濾菌絲后吸取孢子懸浮液500 μL于薄壁的12個小離心管中；分別置于 42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62℃的水浴鍋中水浴10 min；之后迅速置于冰上冰浴10 min；分別吸取100 μL不同溫度處理后的孢子懸浮液于PDA平板上，均勻涂板，每個溫度3次重復。25℃培養，5 d后觀察菌落形成情況。

1.2.5 不同碳、氮源對菌絲生長及產孢的影響 以不加碳源的查氏培養基為基礎培養基，分別加入含等量碳源的果糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、肌醇，以配成不同碳源培養基，無碳源培養基作為對照；同法以含等量氮源的硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、精氨酸、肌氨酸、天冬氨酸配置不同氮源的培養基，以無氮源培養基為對照。以7 mm菌絲塊接于不同碳源或氮源培養基上，28℃恒溫箱中培養5 d后測量菌落直徑，7 d后測定菌落產孢量。

1.2.6 殺菌劑的室內篩選 采用含毒介質法進行病原菌的室內藥劑篩選試驗。取直徑7 mm的菌餅接種到事先配制的含藥培養基上，每個處理重復3次，置于28℃恒溫箱中培養，以無菌水為對照。每隔1天觀察一次，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。根據菌落平均直徑求得各藥劑抑菌率，采用DPS V7.0軟件對藥劑濃度、抑菌率進行統計分析，求得各殺菌劑毒力回歸方程及EC50值。

2 結果與分析

2.1 溫度對菌絲生長和產孢的影響

從圖1中可以看出，該菌可在10～36℃溫度下生長；最適生長溫度為25～31℃，28℃時菌落生長最快；超過28℃，隨著溫度的升高，菌落直徑不斷減小。從產孢量來看，不同溫度對產孢量影響較大，13～36℃下菌落均能產生孢子，28～35℃為最適產孢溫度，34℃時產孢量達到最大。

圖1 溫度對尖孢鐮刀菌百合專化型菌絲生長（5 d）及產孢（7 d）的影響

2.2 pH值對菌絲生長和產孢的影響

從圖2中可以看出，菌落在pH值為4～12時均能生長，菌落菌絲凈重在pH為5時達到最大。這表明：菌落在中性偏酸和堿性的環境都能生長，在弱酸性環境下菌絲凈重增長最快，弱酸性環境中更有利于菌落生長。pH值對菌落產孢量的影響呈現雙峰曲線，在中性偏酸（pH=6）或中性偏堿（pH=9）環境中更有利于該菌產孢。酸性環境下產孢量下降得更快，表明偏堿性環境中更有利于產孢。

圖2 pH值對尖孢鐮刀菌百合專化型生長（5 d）及產孢（7 d）的影響

2.3 不同光照條件對病原菌菌絲生長及產孢的影響

從表1中可以看出，光照對菌絲會產生一定的影響，以交替光照條件下菌絲生長和產孢情況最佳，全黑暗條件下菌絲生長和產孢情況最差。這說明交替光照條件下，有利于尖孢鐮刀菌菌絲的生長和產孢；全黑暗條件對尖孢鐮刀菌百合專化型菌絲的生長和產孢最不利。

表1 光照對尖孢鐮刀菌百合專化型生長（5 d）及產孢（5 d）的影響

2.4 分生孢子致死溫度的測定

分生孢子經不同溫度處理后，在PDA培養基上產生的菌落個數有較明顯差別。根據是否長出菌落，了解分生孢子的存活情況。結果表明，低于52℃處理，菌落可以生長，52℃或超過52℃處理不產生菌落。因此，判定該菌致死溫度為52℃。

2.5 不同碳、氮源對菌絲生長及產孢的影響

2.5.1 碳源對尖孢鐮刀菌百合專化型的影響 從表2中可以看出，尖孢鐮刀菌百合專化型在果糖等8種碳源中均能生長。其中，在果糖、蔗糖中，生長最好；在半乳糖，α-乳糖中生長最差。在無碳培養基中，菌絲能生長，但菌絲較稀薄。尖孢鐮刀菌百合專化型在果糖等7種碳源中均能產孢子。其中，葡萄糖、果糖產孢量最大，分別達到3.825×107個/皿、2.925×107個/皿；在半乳糖、麥芽糖中產孢量最小，分別為 6.45×106個/皿、7.80×106個/皿。在無碳培養基中不產孢。

表2 碳源對尖孢鐮刀菌百合轉化型菌絲生長和產孢的影響

2.5.2 氮源對尖孢鐮刀菌百合專化型的影響 從表3中可以看出，尖孢鐮刀菌百合轉化型在L-精氨酸、硫酸銨、L-脯氨酸、硝酸鉀、甘氨酸、L-酪氨酸、天冬氨酸、無氮培養基中均能生長。其中，在天冬氨酸、L-脯氨酸中，菌落直徑最大；在硫酸銨、甘氨酸中，菌落直徑最小。在無氮培養基中，菌絲能生長，但菌絲較稀薄。尖孢鐮刀菌百合轉化型在L-精氨酸、硫酸銨、L-脯氨酸、硝酸鉀、甘氨酸、L-酪氨酸、天冬氨酸中均能產孢。其中，硝酸鉀的產孢量最多，達到7.507 5×108個/皿；其次是 L-酪氨酸，達到 8.527 5×107個/皿；在硫酸銨中產孢最少，只有6.75×105個/皿。在無氮培養基中不產孢。

表3 氮源對尖孢鐮刀菌百合轉化型菌絲生長及產孢的影響

2.6 殺菌劑的室內篩選

為了解各殺菌劑對尖孢鐮刀菌百合專化型菌株的作用，試驗測定了75%百菌清WP等13種常用殺菌劑對尖孢鐮刀菌百合專化型菌株的EC50值，結果如表4。13種殺菌劑的EC50值大小順序為：72%甲霜靈-錳鋅>50%烯酰嗎啉>70%丙森鋅>嘧菌酯>50%代森錳鋅>50%福美雙>75%百菌清>99%惡霉靈>3%中生菌素>5%己唑醇>10%苯醚甲環唑>腈菌·福美雙>12.5%烯唑醇。其中，12.5%烯唑醇WP、腈菌·福美雙WP、10%苯醚甲環唑WG、5%己唑醇ME、3%中生菌素WP抑制病菌菌絲生長效果最好，EC50分 別 為 1.080 4、2.228 4、2.616 2、5.121 2、16.192 0 mg/L。75%百菌清WP、99%惡霉靈DP、50%福美雙WP抑菌效果次之，EC50分別為70.780 9、62.958 2、71.270 9 mg/L。50%代森錳鋅 WP、70%丙森鋅、50%烯酰嗎啉WG、72%甲霜靈-錳鋅WP效果最差，EC50分別為 216.149 0、611.299 7、830.275 5、4 614.198 4 mg/L，遠高于其他藥劑的EC50。

表4 不同殺菌劑對尖孢鐮刀菌百合專化型菌株的毒力測定

3 結論與討論

3.1 百合鱗莖腐爛病的生物學特性

對尖孢鐮刀菌百合專化型生物學特性的研究結果表明，菌絲生長最適溫度為28℃，產孢最適溫度為34℃；孢子致死溫度為52℃；pH在4～12的范圍內該菌均能生長和產孢，pH值為5時菌絲生長最快，pH值為6時產孢量最大；交替光照對菌絲生長、產孢最好；在供試碳源中，菌絲生長及產孢均以果糖最好；在供試氮源中，天冬氨酸最利于菌絲生長，硝酸鉀最利于產孢。這些結論與朱茂山[3]、李曉琴[4]等對尖孢鐮刀菌生物學特性研究報道基本一致，但在最適pH值、光照影響等方面存在一定的差異。

3.2 室內藥劑的篩選

試驗中苯醚甲環唑、惡霉靈、腈菌·福美雙、代森錳鋅、丙森鋅、烯酰嗎啉、甲霜靈-錳鋅的抑菌效果與梁巧蘭等對尖孢鐮刀菌藥劑防治研究的結果基本一致[5-8]。其中抑菌效果最好的烯唑醇、腈菌·福美雙、苯醚甲環唑、己唑醇均屬于三唑類殺菌劑。三唑類殺菌劑是一類重要的內吸性殺菌劑，其用于尖孢鐮刀菌的防治的報道還不多見，僅在安智慧等[6]對百合鐮刀菌枯萎病防治藥劑的研究中首次提到三唑類殺菌劑對百合枯萎病防治效果好。該試驗通過進一步研究，驗證了三唑類藥劑對尖孢鐮刀菌的防治效果。

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