復合丹參的絲素/膠原支架培養牙周膜成纖維細胞應用效果觀察

杜 暘，金 鼎，高秀秋

(遼寧醫學院附屬第二醫院，遼寧錦州121000)

人牙周膜成纖維細胞(HPDLFs)的增殖分化是牙周組織再生重建的關鍵。但是在牙周病損區域HPDLFs細胞相對較少。將體外構建的HPDLFs-細胞支架復合體移植入牙周缺損區是一種重要牙周病治療方法［1，2］，但尚無滿意細胞支架可用。2011年10月～12月，我們將丹參復合在絲素/膠原支架上，得到復合丹參的絲素/膠原支架，并用其體外培養HPDLFs，效果滿意。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選臨床上12歲左右因正畸拔除的健康前磨牙，家蠶的桑蠶繭。主要試劑:膠原(上海生工生物試劑公司，主要成分為Ⅰ型膠原)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司產品)，DMEM高糖培養基(GIBCO，美國)，胰蛋白酶(Amresco)，細胞培養板(Costar，美國)，抗廣譜角蛋白抗體(武漢博士德公司)，抗波形蛋白抗體(Vimentin)，丹參提取物(美晨藥業有限公司)。儀器設備:倒置顯微鏡(日本Olympus)，S-3000N型掃描電鏡(Hitachi，日本)，HPll00高效液相色譜儀，CO2恒溫培養箱(Thermo，美國)，冷凍干燥機(VIRTIS GENESIS 25 LE型)，超凈工作臺(國產TDGC-2J-1型)。

1.2 方法

1.2.1 復合丹參的絲素/膠原細胞支架的制備 蠶絲置于98～100℃的含0.1%的Na2CO3溶液中處理30 min，重復3次，晾干后溶解于摩爾比為1∶2∶8的CaCl2·CH3CH2OH·H2O三元溶劑中，在(70± 2)℃攪拌溶解，依次進行透析、過濾、濃縮后獲得絲素水溶液。按膠原絲素水溶液質量比80∶20混合，添加一定量的戊二醛，充分攪拌，用冷凍干燥機，分別依次于－80℃、－40℃及－20℃冷凍6 h，隨后減壓干燥，得到膠原/絲素支架。在75%乙醇中滅菌處理后，紫外線照射，晾干。每個支架均勻滴入大約含有20 ng的丹參，再次凍干備用。

1.2.2 復合支架上丹參釋放情況的檢測 取8塊復合丹參的支架、2塊直接滴入20 ng丹參的空白支架，分別為觀察組和對照組。將其置入轉速為100轉/min、溫度為37℃的轉籃進入釋放池計時。分別在30 min、1 h、2 h、4 h、24 h、1周、2周、4周吸出培養液作為檢測樣本，以高效液相色譜法檢測丹參的有效成分含量，計算各時點丹參釋放量占總釋放量的百分比。

1.2.3 HPDLFs的原代培養及鑒定 取正畸拔除的上頜第1前磨牙，用PBS液反復沖洗，無菌條件刮取牙取根中1/3的牙周組織，均勻剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，均勻布在培養瓶底，將此培養瓶倒置放置于CO2培養箱內(37℃、5%CO2、100%濕度)，4 h后翻轉，以4 mL含胎牛血清青鏈霉素的DMEM培養液，CO2培養箱繼續靜置孵育，每3 d更換培養液1次，倒置相差顯微鏡下觀察，待細胞達到匯合點時，進行消化傳代。原代培養傳至第4代用于實驗。以SABC法檢測角蛋白、波形蛋白抗體鑒定細胞來源。

1.2.4 HPDLFs接種及分組 將傳代培養第4代HPDLFs用0.25%胰酶消化后稀釋至1×106/mL，接種于復合丹參的絲素/膠原細胞支架上。置于37℃、5%CO2孵箱中。靜置4 h后，以2.0 mL含胎牛血清青鏈霉素的DMEM培養液，CO2孵箱中靜置孵育，每隔3 d換液1次。

1.2.5 HPDLFs增殖情況及支架結構的觀察 取7 d時細胞材料復合物，PBS沖洗，2.5%戊二醛固定，再經過乙醇梯度系列脫水，離子噴射儀噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.6 HPDLFs增殖的檢測方法 采用MTT法。取上述方法制取的含丹參與不含丹參的支架各24塊，分別置于24孔培養板中，為實驗組和對照組。取生長狀態良好的貼壁HPDLFs用0.25%胰酶消化，調整細胞濃度為1×104/mL，按上述方法接種于支架材料，分別于第1、7、14和28天取出樣本各5塊，每mL分別加入5 mg不含血清的DMEM 900 μL及MTT 100 μL繼續培養4 h后，吸去培養液，加入二甲基亞砜，振蕩30 min直至結晶物充分溶解，于490 nm的波長下測光密度值，每孔測3次，取平均值。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件。組間比較采用成組t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組支架上丹參釋放情況 觀察組的丹參在4 h內就釋放了將近50%，24 h內釋放掉總量的近60%，1周釋放掉總量的近75%，2周時達85%，4周基本釋放完全。對照組在24 h時基本釋放完全。見表1。

2.2 HPDLFs增殖情況及支架結構 掃描電鏡觀察可見絲素/膠原支架有良好的多孔狀結構。HPDLCs在支架上，伸展充分，貼附牢固。

表1 兩組各時間點丹參釋放率比較(±s)

表1 兩組各時間點丹參釋放率比較(±s)

注:與對照組相比，*P＜0.05

0.5 h 2 h 4 h 24 h 72 h 168 h 336 h 672 h對照組 52.1±0.3 78.1±0.5 88.9±0.4 90.6±0.3 94.3±0.組別 丹參釋放率(%) 3 95.4±0.2 96.4±0.5 99.2±0.6觀察組 20.0±0.5* 30.6±0.4* 49.5±0.3* 62.5±0.5* 70.3±0.3* 75.5±0.2* 85.0±0.2* 95.3±0.3*

2.3 HPDLFs增殖情況 接種后第1、7、14和28天兩組光密度值見表2。

表2 兩組接種后各時點光密度值比較(±s)

表2 兩組接種后各時點光密度值比較(±s)

注:與對照組相比，*P＜0.05

組別 光密度值1 d 7 d 14 d 28 d實驗組 0.8±0.4 1.6±0.4* 2.2±0.4* 2.4±0.4*對照組0.7±0.1 1.1±0.1 1.5±0.1 1.7±0.2

3 討論

丹參是我國傳統中藥，能夠促進牙周組織的再生。有學者觀察到用丹參復合的生物膜在誘導牙骨質和牙槽骨的再生方面能有很大的作用［3］。研究表明，丹參具有改善局部組織的微循環的作用，能夠增加血液的供應;丹參能夠提升局部組織促細胞免疫，保證了局部微環境中各種細胞生長因子的產生，從而起到了影響組織再生和修復細胞再生的作用［4～6］。其機制可能是加速了鄰近骨組織中鋅的動員以及提高血清鋅含量，并通過提高支架內骨化物中鋅含量、鋅/銅比值來加速組織生長和鈣化過程［7］。

絲素膠原復合膜是一種載藥膜緩釋系統，具有良好的生物相容性［8，9］，且膠原有低免疫原性，是一種天然的具有兩性荷電性能的聚氨基酸膜。其本身具有特殊的多孔網狀結構，因而具有優良的吸附及緩釋功能［10］。本實驗制取的復合膜其孔隙率在75%以上［11］有著良好的空間結構，促進了HPDLCs的生長、黏附及增殖且無細胞毒性。

本研究以凍干法復合絲素/膠原作為丹參的控釋材料，在4周時仍能檢測到丹參的少量釋放，而在無控釋材料的情況下，丹參24 h內即降解完畢，說明控釋材料較大程度地延長了丹參的作用時間，一定程度上控制了有效因子的釋放。經MTT實驗檢測，在第21天內丹參仍能釋放出有效濃度，從而促進HPDLFs的增殖。當然，復合材料對丹參的控釋過程并不完善，實驗過程中發現早期過多過快，釋放的量不能與時間配合以滿足臨床治療。因此，如何改進材料的控釋效應做進一步研究。

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