原發(fā)性膽汁性肝硬化患者特異性自身抗體的實驗研究

1 資料與方法

1.1 臨床資料 48例PBC及182例非PBC患者均為南昌大學第二附屬醫(yī)院及第一附屬醫(yī)院2008年1月～2011年6月門診、住院確診病例，診斷標準參照2009年美國肝病學會(AASLD)關于PBC診斷建議［1］。其中182例非PBC患者分別為AIH 29例，原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)11例，病毒性肝炎患者72例，其中乙型肝炎(HB)51例、丙型肝炎(HC)21例;結(jié)締組織病患者70例，其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE) 28例、干燥綜合征(SS)20例、類風濕關節(jié)炎(RA)22例。對照組50例，均為健康體檢者。

1.2 試劑與方法

1.2.1 標本的采集所采的被檢標本均為空腹不抗凝血2～3 mL，以2 500 r/min速度離心15 min分離血清，－20℃冷凍待檢。

1.2.2 檢測方法檢測ANA、抗雙鏈DNA抗體(ds-DNA)、AMA、抗平滑肌抗體(SMA)及抗細胞質(zhì)抗體(ACYA)采用歐蒙醫(yī)學實驗診斷有限公司生產(chǎn)的免疫熒光試劑，應用間接免疫熒光法檢測。檢測方法為檢查加樣板，生物載片恢復至室溫，稀釋血清，設陰、陽性對照、質(zhì)控對照，加25 μL稀釋后血清，至加樣板的每一反應區(qū)。再將生物薄片蓋于加樣板的凹槽里，室溫孵育30 min，沖洗，加熒光素20 μL。室溫孵育30 min，再沖洗，封片鏡檢。檢測抗線粒體抗體 M2亞型(AMA-M2)、抗 GP210和抗SP100抗體采用歐蒙醫(yī)學實驗診斷有限公司生產(chǎn)的免疫印跡試劑，嚴格按操作說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組計數(shù)資料用χ2檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料共納入48例PBC患者，其中男6例、女42例，男女比例為1∶7;確診時年齡26～71歲、平均45.6歲。患者均無特殊臨床表現(xiàn)。因肝功能異常就診，確診時間為0.5～22個月、平均8.1個月;29例AIH和11例PSC患者中男5例、女35例，男女比例為1∶7，確診時年齡4～67歲、平均44歲; 72例病毒性肝炎患者中男30例、女42例，男女比例為1∶1.4，確診時年齡17～57歲、平均38歲;70例結(jié)締組織病患者中男7例、女63例，男女比例為1:10，確診時年齡11～65歲、平均37歲;50例對照組中男20例、女30例，年齡23～47歲、平均33歲。

2.2 間接免疫熒光法檢測結(jié)果見表1。

表1 間接免疫熒光法檢測抗體結(jié)果［例(%)］

2.3 免疫印跡法檢測結(jié)果見表2。

表2 免疫印跡法檢測抗體結(jié)果［例(%)］

2.4 臨床評價指標結(jié)果見表3。

3 討論

PBC是一種非臨床常見病，我國尚無PBC完整的流行病學資料，隨著對疾病認識和檢驗水平的提高，PBC發(fā)病率也逐年升高。PBC一般在50歲左右發(fā)病，多見于中年女性，男女之比約為1∶8［2，3］。本研究病例數(shù)男女之比為1∶7，平均年齡45.6歲。PBC的確切病因和發(fā)病機制尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)，PBC發(fā)病與病原微生物感染、自身免疫、接觸化學物品、遺傳和環(huán)境因素等有關［4］，這與自身免疫病的發(fā)病機制極為相近。本組病例存在ANA、AMA及GP210等多種與自身免疫病相關的自身抗體，這不僅表明免疫機制參與了PBC的發(fā)生，同時亦對PBC診斷提供了有力的實驗室依據(jù)。PBC患者常伴有ANA的升高，其陽性率各不相同，甚至在AMA陰性患者中更常見，陽性率僅次于AMA。分析Hep-2細胞上的ANA熒光核型發(fā)現(xiàn)，ANA陽性PBC患者的熒光核型表現(xiàn)具有特殊性，分別為細胞質(zhì)型、核膜型、核多點型和著絲點型。本研究48例PBC患者中的ANA陽性20例，陽性率為41.7%。ANA的檢出率與PBC患者AMA的滴度明顯相關，其AMA和AMA-M2抗體水平越高，ANA的檢出率越高。目前，AMA陰性PBC的病例逐漸增加，其診斷主要依靠臨床表現(xiàn)和肝臟組織學診斷，缺乏特異性的指標，診斷較困難。因此，這些患者其血清非器官特異性的自身抗體檢測尤其重要。

表3 PBC等患者抗體檢測的各項實驗評價指標結(jié)果

AMA是一種以線粒體為靶抗原，無種屬和器官特異性的自身抗體，該抗體能在PBC患者血清中檢出。線粒體存在于多種組織細胞，線粒體抗原位于線粒體內(nèi)外膜，AMA作為一種自身抗體可進入細胞，直接與線粒體抗原作用，導致組織細胞的損傷。PBC與自身免疫反應密切相關，但其發(fā)生機制仍不完全明了，Subasic'等［5］認為病毒可能參與激活自身免疫性疾病及自身抗體的產(chǎn)生。我們檢測48例PBC，AMA陽性45例，陽性率達93.8%，而非PBC陽性率只有19.2%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義，與文獻報道基本一致［2］。目前為止，發(fā)現(xiàn)AMA膜上存在9種自身抗原(M1～9)，與PBC關系最大的是M2，M2伴M4、M8陽性多見于PBC［6］。AMA是PBC的血清學標志，其中AMA-M2對PBC有高度的敏感性和特異性。血清抗AMA-M2抗體診斷PBC的特異性比較高，為本病突出的免疫學指標異常，也是最重要的診斷手段。本研究檢測結(jié)果陽性33例，陽性率為68.8%，與非PBC比較，差異均有統(tǒng)計學意義，同Milkiewicz等［6］結(jié)果基本一致。

抗GP210抗體的靶抗原是位于核孔復合物上的210 kD跨膜糖蛋白，所識別的表位是GP210羧基末端上的15個氨基酸殘基，故名為GP210。其抗原決定簇為氨基末端的15個線樣氨基酸片段和羧基末端的氨基酸片段。抗GP210抗體對PBC診斷的敏感性不高，只有41.7%，但特異性則高達97.4%，尤其是在AMA陰性的PBC患者中有非常強的診斷價值，這和Nakamura等的結(jié)果基本一致。

SP100蛋白是1個磷酸化的細胞核蛋白，電泳時其分子量為100 kD。SP100是一轉(zhuǎn)錄活化因子，用SV40和JC病毒轉(zhuǎn)化細胞，或者用有絲分裂原刺激淋巴細胞，以及用干擾素處理細胞都可觀察到SP100蛋白水平和mRNA水平的升高［4］。SP100為核多點型靶抗原之一，是通過負向調(diào)節(jié)內(nèi)皮素1的作用來實現(xiàn)其生物學作用的。本研究對48例PBC患者檢測抗SP100抗體陽性8例，陽性率為16.7%，其AIH、PSC和HB等及對照組均不敏感。

總之，應用免疫熒光法和免疫印跡法對PBC患者檢測AMA、AMA-M2、抗GP210和SP100等多種自身抗體，在臨床上對PBC具有廣闊應用前景，將會對PBC患者的診斷、鑒別診斷、治療及預后具有重要的作用，可提高PBC診療水平。

［1］Lindor KD，Gershwin ME，Poupon R，et al.Primary biliary cirrhosis［J］.Hepatology，2009，50(1):291-308.

［2］Cavazzana I，Ceribelli A，Taraborelli M，et al.Primary biliary cirrhosis-related autoantibodies in a large cohort of italian patients with systemic sclerosis［J］.J Rheumatol，2011，38(10):2180-2185.

［3］Sfakianaki O，Koulentaki M，Tzardi M，et al.Peri-nuclear antibodies correlate with survival in Greek primary biliary cirrhosis patients［J］.World J Gastroenterol，2010，16(39):4938-4943.

［4］Norman GL，Bialek A，Encabo S，et al.Is prevalence of PBC underestimated in patients with systemic sclerosis［J］.Dig Liver Dis，2009，41(10):762-764.

［5］Subasi'c D，Karamehi'c J，Ljuca F，et al.Correlation of autoantibodies presence detected by IFA-anti-dsDNA，IFA-AMA and immunoblotting with corresponding data in clinical management of autoimmune diseases［J］.Bosn J Basic Med Sci，2008，8(1):86-92.

［6］Milkiewicz P，Buwaneswaran H，Coltescu C，et al.Value of autoantibody analysis in the differential diagnosis of chronic cholestatic liver disease［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2009，7(12): 1355-1360.