幽門螺桿菌根除失敗后阿莫西林耐藥基因分析

朱振華，呂農華，黃德強，謝 勇，王崇文，劉林林

(南昌大學第一附屬醫院，南昌330006)

幽門螺桿菌(Hp)在人群中感染率很高，在慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤等消化系統疾病的發生、發展過程中起重要作用［1～3］;此外，該菌還與某些肝膽、心腦血管及皮膚病等有關。消化學界認為根除Hp是防治這些疾病的重要措施。我國屬于發展中國家，在全球范圍內屬于感染率較高的地區，因此Hp根除治療顯得尤為重要。阿莫西林是根除Hp感染治療中重要的抗生素，其耐藥是Hp根除失敗的主要原因之一。我們于2006年5月～2007年1月進行本研究，探討Hp根除治療失敗后阿莫西林的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 菌株 Hp菌株來自于南昌大學第一附屬醫院消化科內鏡室，其中阿莫西林敏感菌株5株，原始耐藥菌株6株，根除治療失敗后的耐藥菌株4株。

1.2 藥敏實驗 采用紙片擴散法(K-B法)，根據藥敏實驗中抑菌圈的大小來判定臨床菌株是否耐藥。結果判斷:用卡尺量取抑菌圈直徑。Hp耐藥標準［4］:抑菌圈直徑＜30 mm。質量控制:藥敏實驗加入標準敏感菌株Hp11637，作為敏感對照菌株。

1.3 耐藥基因的PCR擴增 采用北京天為時代科技有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)制備Hp基因組DNA。PCR擴增采用高保真PCR擴增試劑盒擴增Hp PBP1A的1 048 bp片段，PCR擴增分兩輪進行:第一輪PCR反應體系由5 μL 2×pfu PCR mastermix、2.5 μL ddH2O、1 μL上游引物、1 μL下游引物及0.5 μL DNA模板組成，總體積為10 μL。上游引物:5'-GCGTCTAATGAAGATGAAGA-3'，下游引物:5'-TTAAAGTCCCTATAGCCATG-3'。PCR擴增反應條件:94℃4 min預變性;94℃1 min變性，61.5℃40 s退火，72℃1.5 min延伸，共30個循環;72℃7 min延伸。PCR反應產物于－20℃保存備用。第二輪PCR反應體系由20 μL 2×pfu PCR mastermix、10 μL ddH2O、4 μL上游引物、4 μL下游引物及2 μL DNA模板組成，總體積為40 μL。上游引物:5'-GCGTCTAATGAAGATGAAGA-3'，下游引物:5'-TTAAAGTCCCTATAGCCATG-3'。PCR擴增反應條件:94℃4 min預變性;94℃ 1 min變性，61.5℃ 40 s退火，72℃1.5 min延伸，共35個循環;72℃7 min延伸。PCR反應產物經2%瓊脂糖凝膠電泳觀察。采用北京天為時代科技有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)回收純化PCR產物。

1.4 DNA測序及對比分析 將所有回收純化的PCR產物送上海捷瑞生物工程有限公司進行DNA測序。采用DNA Star軟件包對測序結果閱讀、整理，對比分析原始耐藥、敏感菌株、根除失敗后耐藥菌株及標準菌株的耐藥基因差異。

1.5 統計學方法 采用統計軟件SPSS13.0分析，描述同源性符合率采用±s，比較各組間同源性的差異時采用方差分析或t檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏實驗 345例菌株中，阿莫西林原始敏感菌株322例，原始耐藥菌株23例，原始耐藥率達6.7%。另20例根除治療失敗的Hp菌株中，阿莫西林耐藥菌株5例，敏感菌株15例。

2.2 耐藥基因PBP1A的PCR產物 原始耐藥菌株6株，敏感菌株5株，根除失敗后耐藥菌株4株，其PCR產物均出現1 048 bp(26695 Hp0597 PBP1A的一部分)的條帶，未見異常條帶。圖1為根除失敗的4株耐藥菌株電泳圖。

圖1 PBP1A基因PCR產物電泳結果

2.3 23S rRNA的突變分析

2.3.1 臨床菌株與標準菌株Hp26695同源性比較

成功完成DNA測序者原始阿莫西林耐藥菌株6株、敏感菌株5株和根除失敗后耐藥菌株4株。采用DNA Star軟件包中MegAlign軟件將臨床菌株的PBP1A序列與Hp26695的PBP1A序列進行同源性比較，同源性分別為90.26%±3.45%、95.52%± 2.73%、95.48%±0.89%，P＞0.05，臨床菌株與標準菌株的同源性結果基本相似。

2.3.2 臨床菌株的框移突變情況 對臨床菌株的PBP1A基因框移突變進行比較，采用DNA Star軟件包中 MegAlign軟件將臨床菌株與標準菌株Hp26695 PBP1A對比進行DNA分析，結果表明:臨床耐藥菌株的框移突變比敏感菌株發生率高，阿莫西林敏感菌株框移突變0例，原始耐藥菌株2例，根除失敗后耐藥菌株1例。其中2株原始耐藥菌株與1株根除失敗的耐藥菌株發生框移突變導致突變以后的蛋白質氨基酸的翻譯發生嚴重改變，其他耐藥菌株突變主要為堿基的替代，只引起單個氨基酸改變，不導致整條肽鏈的改變;而在敏感菌株未見任何框移突變。由于例數過少，故未做統計學分析。

2.3.3 臨床菌株與標準菌株氨基酸序列同源性比較 采用DNA Star軟件包中的MegAlign軟件，將臨床菌株與Hp26695氨基酸序列進行同源性比較，結果表明:原始耐藥菌株和根除失敗后耐藥菌株的PBP1A氨基酸序列同源性比敏感菌株低。方差分析示，原始敏感菌株(93.28%±6.21%)與原始耐藥菌株(40.52%±18.48%)及根除失敗后耐藥菌株(80.05%±32.01%)兩兩比較，差異有統計學意義，P＜0.05。

3 討論

β-內酰胺類抗生素在體外有很高的抗Hp活性，阿莫西林是臨床上惟一用于治療Hp感染的β-內酰胺類抗生素，它在酸性環境下高度穩定，可專一地與細菌內膜上靶位點結合干擾細菌細胞壁黏肽合成，使細菌胞壁缺損，菌體膨脹裂解而致細菌死亡。那些能與青霉素G共價結合的細菌內膜靶位點被稱之為青霉素結合蛋白(PBPs)，它是一系列合成細菌細胞壁肽聚糖層的酶。最初研究［5］顯示，有3種高分子量 PBPs存在，被命名為 PBP1、PBP2和PBP3。后來又發現一種低分子量PBPs，被命名為PBP4［6］。PBP1A基因作為PBP1蛋白的編碼基因之一，與 Hp阿莫西林耐藥性密切相關。Gerrits等［7］用阿莫西林耐藥菌株的PBP1A基因替代敏感菌株1061的PBP1A基因，使敏感菌株1061的最低抑菌濃度增加了100倍，序列分析發現PBP1蛋白中存在絲氨酸414→精氨酸置換，因此他們認為在PBP1蛋白中的氨基酸置換會導致阿莫西林最低抑菌濃度的升高。有文獻報道，阿莫西林耐藥還與β-內酰胺酶有關，但Dore等［8］研究發現所有對阿莫西林耐藥的菌株β-內酰胺酶均陰性;且大量臨床研究也證實β-內酰胺酶抑制劑并不能使含阿莫西林的根除方案根除率提高。由此可以看出β-內酰胺酶仍難以解釋阿莫西林耐藥，而PBP1A基因突變才可能是阿莫西林耐藥性產生的主要原因。

本課題通過對原始敏感菌株、耐藥菌株和根除失敗后耐藥菌株的研究，發現原始耐藥菌株及根除失敗后耐藥菌株PBP1A基因核苷酸的同源性與敏感菌株統計學上無顯著差異;根除失敗后耐藥菌株突變頻率稍低于原始耐藥菌株，這可能與原始耐藥菌株受長期外界刺激、抽樣誤差及樣本含量過少有關。通過氨基酸序列對比發現，原始耐藥菌株和根除失敗后的耐藥菌株PBP1氨基酸序列同源性均低于敏感菌株，提示氨基酸的置換可能會導致耐藥性的產生。尤其是其中3株耐藥菌株因堿基的缺失或插入導致框移突變，造成蛋白質氨基酸排列順序發生改變，其后果是翻譯出的蛋白質完全不同而最終導致阿莫西林無法與Hp結合，耐藥性便隨之產生。而在我們所研究的敏感菌株中未發現一株出現框移突變。因此，我們認為PBP1蛋白的氨基酸置換可能與阿莫西林耐藥有密切關系。理論上講，有框移突變的臨床菌株耐藥程度應該顯著高于其他形式突變所致的耐藥菌株，但由于我們的藥敏實驗方法適用于確定耐藥性，在確定耐藥程度上還有一定缺陷，而E-test法相對比較準確。下一步可考慮對這幾株出現框移突變的菌株進行E-test藥敏法確定其耐藥程度，以明確框移突變在引起耐藥性及耐藥程度方面所起的作用。雖然E-test藥敏法較為精確且方便，但其昂貴的價格并不適于我們進行大規模的藥敏實驗，因此我們藥敏實驗在初篩時還是首選紙片擴散法。

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