FXR調控下Bsep在高脂血癥大鼠膽固醇代謝中的作用機制

張孟瑜，賀 凱，李 波，夏先明

(瀘州醫學院附屬醫院，四川瀘州646000)

高脂血癥是由于脂質代謝或運轉異常使血漿中一種或多種脂質高于正常范圍的病癥，分為原發性和繼發性兩類。近年來，由于人們生活習慣特別是飲食習慣改變等多種因素的影響，高脂血癥的發病率有明顯增高的趨勢，是當前的常見病、多發病。膽固醇代謝紊亂是其中的重要組成部分。而目前降脂治療的方法有限。我們于2009年4月～2010年8月進行本研究，擬以法尼基衍生物X受體(FXR)及FXR的靶基因——肝臟中小膽管側肝細胞毛細膽管膜上分布的膽鹽輸出泵(Bsep)為研究對象，研究在高脂血癥大鼠肝細胞中FXR、Bsep基因表達的狀況，嘗試為高脂血癥治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠來自瀘州醫學院動物中心，雄性、體質量(145±8.5)g，60只，隨機分為2組，每組30只，高脂飲食實驗組(簡稱實驗組)、普通飲食對照組(簡稱對照組)。入選前大鼠無高脂血癥和其他疾病存在。

1.2 儀器和試劑 主要儀器有石蠟切片機，自動組織包埋機，光學顯微鏡照相系統，Image-Pro-Plus圖像分析系統等;主要試劑有免疫組化試劑盒，FXR單克隆抗體及Bsep單克隆抗體等(CHEMICON，美國)。

1.3 實驗方法 高脂飲食的原料包括:膽固醇、去氧膽酸鈉及基礎飼料等。配制時在基礎飼料中按一定質量分數分別加入膽固醇、豬油、蔗糖、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶，加水混合充分攪拌，做成拳頭大小烘干，冷藏備用。喂食3個月，實驗組建立高脂血癥大鼠模型;對照組喂以基礎飼料，飲用普通自來水。定期測定大鼠體質量，并于3個月后取血用自動生化儀檢測與脂類相關生化指標，待確定高脂血癥大鼠模型建立成功后，取實驗組和對照組肝臟組織，石蠟切片后用免疫組化SP法檢測2組大鼠肝臟組織的FXR及Bsep表達強度。

1.4 統計學方法 采用SPSS14.0統計軟件進行分析，測得數據用±s表示，組間差異比較采用t檢驗，免疫組化SP法染色結果采用四格表的Fisher確切概率法檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組大鼠體質量和臟器重量、血清指標變化

2組大鼠喂食3個月均存活，未出現死亡，其體質量和臟器重量的變化見表1，血清中脂類變化指標見表2。

表1 2組大鼠體質量和肝重量的變化(g，±s)

表1 2組大鼠體質量和肝重量的變化(g，±s)

注:與對照組比較，△P＜0.05

組別肝重量對照組 145.36±8.25 168.24±7.34 195.17±9.46 204.69體質量實驗前 第1個月 第2個月 第3個月±6.27 18.02±0.75實驗組 145.56±8.36 175.14±10.65△ 194.75±7.48 202.03±5.19 21.06±0.58△

表2 各組大鼠血清指標的變化(mmol/L，±s)

表2 各組大鼠血清指標的變化(mmol/L，±s)

注:與對照組比較，△P＜0.05

組別 血糖 膽固醇 甘油三酯 高密度脂蛋白 低密度脂蛋白對照組 5.11±0.89 1.45±0.21 0.56±0.15 0.76±0.13 0.19±0.10實驗組 5.13±0.87 3.36±0.42△ 2.85±0.13△ 0.47±0.11△ 0.51±0.12△

2.2 免疫組化SP法染色結果 見插頁Ⅱ圖11。肝臟組織中FXR及Bsep基因出現黃色染色顆粒為陽性細胞(綠色箭頭所指)。每張切片隨機選取5個視野，每個視野內觀察100個細胞，陽性細胞≥10%為陽性，否則為陰性。實驗組FXR基因表達陽性率為75%，對照組為17.3%(χ2=9.932，P＜0.05);實驗組Bsep基因表達陽性率為76.7%，對照組為18.5%(χ2=10.773，P＜0.05)。

3 討論

血脂是人體血液中所含各類脂質的總稱，主要的脂質為膽固醇和中性脂肪(甘油三酯)。通常成年人空腹血清中總膽固醇超過5.72 mmol/L，甘油三酯超過1.70 mmol/L，可診斷為高脂血癥。大量的基礎和臨床研究對高脂血癥原因進行探索，表明其形成與多種因素的參與和作用有關，而膽固醇的過高分泌和代謝障礙、中性脂肪的蓄積是其重要的形成條件，主要有如下幾點:肝臟從血漿脂蛋白獲得膽固醇增多;肝臟內各種膽固醇合成增加;含高膽固醇和高飽和脂肪酸飲食的攝入;肝臟膽固醇胞內轉運及微管膜膽固醇轉運出胞增加;肝臟膽固醇酯水解增加;肝內膽固醇酯化減少;肝內膽汁酸合成減少;中性脂肪的攝入增加;中性脂肪的代謝減少;基礎血漿低密度脂蛋白—膽固醇(LDL-C)偏高;血漿甘油三酯濃度升高;熱量過多、遺傳因素、內分泌代謝性疾病等。這些改變均可引起機體游離膽固醇濃度增加，中性脂肪的含量增加。我國每年因高脂血癥引起的心肌梗死、腦梗死、冠心病、糖尿病、中風等致殘、致死人數呈逐年上升趨勢。在不斷的調查總結和治療中，人們對高脂血癥成因的研究有了很大進展。近年來，人們對其形成的綜合因素更加關注，對高脂血癥發生的分子生物學機制，包括遺傳因素等進行了全面的研究并尋求新的治療方法。而對FXR及其調控下的Bsep的研究發現，高脂血癥時其在膽汁酸及膽固醇代謝中發揮著重要的作用，可為防治高脂血癥提供新的治療方向。

FXR是一種孤兒核受體，具有典型的核受體結構，屬于激素核受體超家族的一員［1～3］。人類ABCB11基因位于第二條染色體長臂上2q24～31，含有28個外顯子，編碼產生一種跨膜ABCB11蛋白，即Bsep。Bsep主要存在于肝臟中，位于肝細胞的毛細膽管面，由1 321個氨基酸組成，屬于ATP結合盒超家族成員。Bsep的表達和功能發生變化則直接導致膽汁酸鹽的分泌排泄發生變化，多種肝臟淤膽性疾病與此相關［4～6］。而大鼠Bsep能轉運與?；墙Y合的鵝脫氧膽酸和熊脫氧膽酸，不轉運甘氨膽酸和游離膽酸，小鼠Bsep則轉運甘氨膽酸，體外動物實驗證實，Bsep基因轉染后的細胞，相應膽汁酸的轉運能力均增強。已經證實，FXR在轉錄水平可誘導Bsep的表達，FXR通過和這些基因啟動子上的FXR反應元件結合從而調控這些基因的表達［7～9］。膽汁酸的肝腸循環則明確表現出FXR與Bsep的相互關系及二者在膽汁酸的分泌及轉運中所起到的相應作用。

本實驗我們已證實高脂血癥時大鼠的FXR與Bsep基因表達增加，說明膽汁酸的增加會伴隨FXR基因、Bsep基因表達增強，相對應來說膽汁酸分泌及轉運也在增強。提示我們，FXR及其靶基因BSEP的發現可能會成為新的治療高脂血癥靶點。Bsep具有特異性，其作用是通過消耗ATP將肝細胞內的膽鹽分泌到毛細膽管中，是影響膽汁形成最重要的因素［10］。在目前臨床應用的降低血清膽固醇藥物中，常用的有膽汁酸螯合劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、苯氧芳酸類等。最常用的他汀類藥物可抑制內源性膽固醇合成的限速酶HMG-CoA還原酶活性，繼發性誘導低密度脂蛋白受體活性，使肝攝取血清LDL-C的能力增加，降低血清LDL-C，被證明是有效的降低LDL-C藥物。然而這些藥物普遍存在服用量大、胃腸道反應明顯、患者耐受性差等缺點，阻礙了其作為臨床治療藥物的廣泛應用。FXR與Bsep基因代謝調節作用的研究將有助于人們更好地認識膽固醇及膽汁酸代謝紊亂機制，為高脂血癥及其相關疾病找到新的治療方法和手段。

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