鼻咽癌中PTTG1與MAPK/ERK信號通路及增殖凋亡的關系

趙穎海，景志亮，黃 坊，李飛虹，陳小毅

(1廣東醫學院，廣東湛江524023;2廣東醫學院附屬醫院;3上海市第一人民醫院寶山分院)

鼻咽癌是一種與EB病毒(EBV)感染密切相關的頭頸部上皮源性惡性腫瘤［1，2］。鼻咽癌EBV感染的頻率因組織學類型不同而異［3］。非角化性未分化型鼻咽癌與EBV感染密切相關，感染率幾乎為100%［4］。EBV感染細胞后可以整合到宿主細胞染色體內，整合位點通常處于染色體脆性位點。EBV在人類染色體上的整合位點有1p、1q、2q、3p、3q、4q、5q、6q、7p、7q、9q、11p、14q和15q等［5］。垂體腫瘤轉化基因(PTTG)是一種新型原癌基因，人類PTTG1基因定位于染色體5q33及5q35.1上，控制著細胞的生長及分化［6］，在抑制細胞凋亡和促進細胞增殖、轉化及腫瘤的發生發展中起著重要的作用［7～12］。胞外信號調節激酶(ERK)屬絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的亞族之一，廣泛參與調節不同細胞增殖、分化、凋亡等過程［13～15］，其cDNA定位于染色體1p34-35，在人類多種腫瘤中可檢測到ERK的活化形式即磷酸化ERK(p-ERK)表達水平增高［16，17］。

那么，在鼻咽癌發生發展過程中，EBV感染是否導致人染色體5q區PTTG1基因和1p區ERK基因的異常表達?其異常表達的意義及可能的調控機制如何?目前國內外文獻未見報道。2006年12月～2011年12月，我們通過本研究對上述問題進行了初步探討，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 33例非角化性未分化型鼻咽癌標本取自中國人民解放軍第四二二醫院病理科2004年1月～2007年12月存檔蠟塊。鼻咽癌患者中，男28例、女8例，年齡24～76歲、中位年齡50歲、平均46.3歲，臨床分期均屬T1N0M0期。所有病例就診前未行放療或化療。所有標本經10%甲醛固定，常規制片。人低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞系為廣東醫學院病理學教研室保存。

1.2 主要試劑 小鼠抗人磷酸化ERK(p-ERK)單克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品(sc-7383)?？剐∈驣gG(HRP)二抗、兔抗人PTTG1多克隆抗體(ZA-0230)、Ki-67單克隆抗體(ZA-0502)等免疫組織化學試劑均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。每一批實驗均設置陽性和陰性對照，陽性對照用已知陽性組織切片，陰性對照用PBS代替一抗。PD98059購自碧云天生物技術研究所，母液濃度為20 mg/mL。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織(細胞)化學檢測 按SP法試劑盒操作說明分別檢測石蠟標本和細胞爬片標本中PTTG1、p-ERK、Ki-67蛋白的表達。

1.3.2 體外CNE-2Z細胞培養及實驗檢測 設立對照組和實驗組。實驗組分別用50、100 μmol/L不同濃度的ERK信號通路阻滯劑PD98059處理CNE-2Z細胞，免疫細胞化學方法檢測PTTG1、p-ERK、Ki-67蛋白的表達;MTT法檢測細胞增殖抑制率;流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.4 免疫組織或細胞化學結果判定標準 對實驗結果進行雙盲法評估，綜合染色強度和陽性細胞數量積分，按半定量方法判斷。按顯色深淺評分:0分，不顯色;1分，淺黃色顯色;2分，棕黃色顯色;3分，棕褐色顯色。按顯色比例評分:顯色細胞數≤5%為0分;顯色細胞數6%～25%為1分;顯色細胞數26%～50%為2分;顯色細胞數51%～75%為3分;顯色細胞數＞75%為4分。以上述兩項乘積的得分值作為判斷標準:1～2分為(－)，3～4分為(+)，5分以上為(++)。PTTG1主要定位于細胞質，也有部分定位于細胞核［11］。p-ERK表達定位于細胞核和細胞質，Ki-67陽性表達定位于細胞核。

1.5 統計學方法 實驗資料采用統計軟件SPSS 13.0做Spearman等級相關分析及單因素方差分析，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織中PTTG1與p-ERK、Ki-67蛋白表達的相關性分析 33例鼻咽癌組織中PTTG1、p-ERK、Ki-67蛋白的陽性表達率分別為81.82%(27/ 33)、66.67%(22/33)、78.79%(26/33)。PTTG1與p-ERK(r=0.345，P=0.042)、Ki-67(r=0.600，P= 0.000)蛋白的陽性表達均呈正相關關系。見表1和封二圖1。

表1 鼻咽癌細胞中PTTG1與p-ERK、Ki-67表達的相關性分析(例，n=33)

2.2 PD98059對鼻咽癌CNE-2Z細胞PTTG1、p-ERK、Ki-67蛋白表達的影響 空白對照組中，鼻咽癌CNE-2Z細胞PTTG1、p-ERK、Ki-67均呈強陽性表達。不同濃度PD98059分別作用于CNE-2Z細胞24、48、72 h后，PTTG1、p-ERK、Ki-67蛋白表達均下降，見封二圖2。

2.3 MTT法檢測PD98059對CNE-2Z細胞增殖的影響 用50、100 μmol/L不同濃度PD98059分別處理CNE-2Z細胞24、48、72 h后，細胞增殖明顯受到抑制，組間差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

2.4 PD98059誘導對鼻咽癌CNE-2Z細胞凋亡的影響 50、100 μmol/L的PD98059分別處理鼻咽癌CNE-2Z細胞24、48、72 h。結果顯示:50 μmol/L的PD98059處理細胞24 h無凋亡，而處理48 h和72 h可檢測到凋亡峰;100 μmol/L PD98059處理細胞24、48和72 h均可檢測到凋亡峰。

表2 PD98059對CNE-2Z細胞增殖的影響

3 討論

PTTG是一種細胞周期調節蛋白，能抑制姐妹染色單體分離，導致染色體不穩定，形成非整倍體，在抑制細胞凋亡和促進細胞增殖、轉化及腫瘤的發生發展中起著重要的作用［6～12］。PTTG以細胞周期依賴性方式表達，PTTG mRNA和蛋白在G1/S交界期表達水平很低，S期逐漸增高，在G2/M交界期達到最高，高表達于G2/M期，當細胞進入G1期后其表達水平又逐漸下降［12，18］。

多種刺激因子如生長因子、細胞因子、病毒、G蛋白耦聯受體的配體等都可通過Ras-Raf-MEK通路的磷酸化激活ERK，p-ERK可能停留在胞質中激活一系列其他蛋白激酶，并在胞質中使細胞骨架成分磷酸化;p-ERK或者呈持續活化的狀態介導信號進入細胞核，通過磷酸化活化轉錄因子而調控多種癌基因的相繼激活，最終介導細胞增殖與分化、細胞凋亡和細胞的惡變(浸潤、侵襲)等多種生物學過程［16，17］。

Ki-67是應用最廣泛的增殖細胞標記物之一。Ki-67隨細胞周期的不同表達量也不同，在G1中期到后期開始表達，S期和G2期漸增，M期達高峰，細胞分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇［19］。

本實驗用免疫組化SP法檢測33例非角化性未分化型鼻咽癌組織中PTTG、p-ERK、Ki-67蛋白表達，陽性表達率分別為81.82%、66.67%、78.79%，PTTG與p-ERK、Ki-67蛋白表達均呈正相關。同時，體外實驗以鼻咽癌細胞系CNE-2Z作為研究對象，用50、100 μmol/L不同濃度的MAPK/ERK信號傳導通路抑制劑PD98059分別處理CNE-2Z細胞24、48、72 h后，同步檢測到p-ERK、PTTG1、Ki-67蛋白表達下降、細胞增殖明顯受抑制及凋亡峰出現。實驗結果初步證實了鼻咽癌中PTTG1高表達，與細胞增殖標記物 ki-67表達呈顯著正相關關系，與MAPK/ERK通路中p-ERK表達呈正相關關系，并提示PTTG1在鼻咽癌中可能通過MAPK/ERK信號通路發揮促進癌細胞增殖及抑制凋亡的生物學作用。

本實驗所檢測的33例樣本病理診斷均為非角化性未分化型鼻咽癌，患者均為粵西地區本土人?；浳鞯貐^非角化性未分化型鼻咽癌EBV潛伏感染率約96%(尚未正式發表的材料)。文獻報道:EBV在人類染色體上的整合位點有1p、1q、2q、3p、3q、4q、5q、6q、7p、7q、9q、11p、14q和15q等［5］。

綜上所述，我們提出，鼻咽癌中EBV潛伏感染可能導致染色體5q區PTTG1基因過度表達，帶來非整倍性細胞分裂導致遺傳不穩定性;同時，可能導致染色體1p區ERK基因異?；罨?，并進一步誘導PTTG1基因過度表達，促進鼻咽癌細胞增殖及抑制其凋亡。本文的研究結果對于進一步探索EBV潛伏感染與鼻咽癌細胞增殖、凋亡和細胞周期轉換等機制具有重要意義。惡性腫瘤細胞異常增殖及凋亡抑制，是惡性腫瘤細胞演進及異質化的重要生物學特點，PTTG1有望成為預測鼻咽癌細胞演進及異質化的重要腫瘤標志物［12］。

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