環氧化酶2在鋁負荷致大鼠海馬神經元損傷中的作用*

吳 柯， 萬立華， 謝靈瑤， 楊俊卿△

(1重慶醫科大學藥學院，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，2重慶醫科大學基礎醫學院法醫學教研室，重慶400016)

有研究證明鋁鹽負荷是成熟的神經元損傷模型之一［1－2］，另一方面，環氧化酶 2(cyclooxygenase 2，COX －2)的表達增加與包括外傷性腦損傷［3］、腦缺血［4］、阿爾茨海默病(Alzheimer disease)［5］等神經病理密切相關。正如大家所熟知，神經元的損傷和慢性炎癥會導致神經回路甚至中樞神經系統的功能失調，那么在炎癥或損傷過程中扮演著關鍵角色的COX－2在海馬、皮層神經元呈現的高表達［6］對于神經元有明顯的致損傷何作用，具體機制仍待探討。本實驗以RNA干擾為手段，以鋁負荷致大鼠海馬神經元損傷為模型，初步探討了COX－2表達與神經元損傷的關系。

材料和方法

1 動物、細胞株和主要試劑

新生24 h內SD大鼠，重慶醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(渝)2007001;293細胞株和COX－2特異性干擾重組腺病毒由重慶醫科大學檢驗系提供;六水三氯化鋁購于國藥化工試劑有限公司;B27購于Gibco;左旋多聚賴氨酸和MTT購于Sigma;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;ECL化學發光試劑盒購于Pierce;COX－2Ⅰ抗購于Santa Cruz。

2 方法

2.1 大鼠海馬神經元原代培養 參照Choi等［7］方法，出生24 h內SD乳鼠，用75%乙醇消毒后，斷頭。超凈臺分離海馬，盡量剔除結締組織和血管，并將組織盡量剪碎，加組織體積5倍的0.125%胰酶消化。250目尼龍網過濾，得到的細胞懸液，800 r/min離心8 min。2次離心后，臺盼藍法對細胞懸液進行活細胞記數。計算細胞存活率(＞95%)并將細胞密度調整為1×106cells/L的細胞懸液，種植于賴氨酸處理的24孔板或96孔板中，37℃、5%CO2培養箱中培養。觀測24 h神經元貼壁后，換B27無血清維持培養液進行培養，每2 d半量換液1次。

2.2 293細胞培養，腺病毒的擴增及滴度的測定 于100 mL培養瓶中種植狀態良好的293細胞，生長至80%融合即用于擴增腺病毒。將1.5 mL腺病毒原液加入到4 mL 10%DEME完全培養液中充分混勻，再加入到PBS洗過的80%融合的293細胞中，37℃、5%CO2培養箱繼續培養。熒光觀察病毒感染率及倒置顯微鏡觀察細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)到明顯熒光且細胞出現明顯的CPE時即到達收病毒時間。3 000 r/min離心，0.5 mL培養液吹散細胞沉淀，37℃至－80℃反復凍融4次，8 000 r/min低溫離心15 min，收集上清液即為擴增好的腺病毒。參照江千里等［8］的方法，進行病毒滴度的測定。病毒滴度(U/L)=103U×計數孔相對于第1孔的稀釋倍數/第1孔加入病毒的體積，即1×10(n+4)U/L，n=計數孔。

2.3 實驗分組 正常大鼠神經元培養至第7 d，分成空載腺病毒組、COX－2特異性干擾腺病毒組、鋁+空載腺病毒組、鋁+COX－2特異性干擾腺病毒組。空載組加入感染復數(multiplicity of infection，MOI)為100的空載病毒量，COX－2特異性干擾腺病毒組加入MOI為100的COX－2特異性干擾病毒量;鋁+空載腺病毒組全量換液成200 μmol·L－1AlCl3培養液，同時加入MOI為100的空載病毒量，鋁+COX－2特異性干擾腺病毒組全量換液成200 μmol·L－1AlCl3培養液，同時加入MOI為100的COX－2特異性干擾病毒量。作用24 h后進行MTT、生化檢測、熒光細胞觀察和蛋白提取。

2.4 Western blotting檢測海馬神經元COX－2蛋白表達收集經干預處理24 h后的細胞，裂解20 min。用Bradford法測定裂解液中總蛋白含量。取細胞裂解液上樣于SDSPAGE聚丙烯酰胺凝膠，每孔50 μg蛋白電泳。電轉移將蛋白轉至硝酸纖維素膜上。加入封閉液過夜，抗靶蛋白抗體溶液與濾膜一同室溫孵育2～3 h，洗膜，加入Ⅱ抗工作液室溫孵育1 h，洗膜，檢測靶蛋白的表達。

2.5 SOD活性和MDA含量測定 大鼠海馬神經元在24孔板中培養至7 d，胰酶消化后，低溫超聲破碎細胞，收集上清液0.2 mL，按照SOD和MDA試劑盒說明書，分別在550 nm和532 nm處測各管吸光度(absorbance，A)。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

SOD活性［103U·(g protein)－1］=(對照管A值－測定管A值)/對照管A值/50% ×反應液總體積/取樣量(mL)/蛋白含量(g·L－1)。MDA［μmol·(g protein)－1］=(測定管A值－測定空白管A值)/(標準管A值－標準空白管A值)×10 μmol·L－1÷蛋白濃度(g·L－1)。

2.6 LDH測定 收集各組培養液上清0.06 mL(設為A溶液)。胰酶消化各組細胞，超聲波破碎細胞，低溫離心收集上清液0.06 mL(設為B溶液)。參照LDH測定試劑盒說明書，于440 nm處測各管A值。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

LDH活性［U·(g protein)－1］=測定管A值－測定空白管A值/標準管A值－標準空白管A值×2 mmol·L－1÷蛋白濃度(g·L－1)，LDH漏出率=A/(A+B)×100%。

2.7 MTT測定 大鼠海馬神經元接種于96孔板，分組及干預同“2.3”方法，24 h后，每孔加入 5 g·L－1MTT溶液 20 μL。繼續培養4 h，除上清，加150 μL DMSO(二甲基亞砜)振蕩以溶解結晶。于570 nm波長處讀取A值。

2.8 神經元病理形態學熒光觀察 腺病毒轉染原代神經元24 h后，熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態。

3 統計學處理

結 果

1 腺病毒滴度

測得COX－2特異性干擾腺病毒滴度=1012U/L，RFP空載腺病毒滴度=1012U/L，然后根據下列公式計算轉染神經元需要加入的病毒量:

MOI=病毒滴度×V(需加入的病毒液體積)/神經元細胞數，即當 MOI=100 時，V=100 μL。

2 COX-2特異性干擾對海馬神經元COX－2蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，單純RNAi組的COX－2蛋白水平明顯低于空載組。鋁+空載腺病毒組COX－2蛋白水平明顯增加，而RNAi+鋁鹽組COX－2蛋白水平明顯下降，見圖1。

Figure 1.Changes of COX－2 protein expression in primary cultured rat hippocampal neurons.1:vector － treated group;2:COX－2 RNAi－treated group;3:vector and aluminum－treated(Al+vector)group;4:COX－2 RNAi and aluminum－treated(Al+COX－2 RNAi)group.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs vector group;##P ＜0.01 vs Al+vector group.圖1 COX－2 RNA干擾對海馬神經元COX－2蛋白表達的影響

3 COX-2干擾對海馬神經元SOD活性、MDA含量、LDH漏出率及神經元活性的影響

與空載組相比，單純RNAi組SOD活性無顯著改變，而鋁+空載腺病毒組SOD活性顯著降低，COX－2 RNAi+鋁鹽組的SOD活性顯著升高，見表1。

與空載組相比，單純RNAi組MDA含量無顯著改變，而鋁+空載腺病毒組MDA含量顯著增加，COX－2 RNAi+鋁鹽組的MDA含量明顯下降，見表1。

與空載組相比，單純RNAi組LDH漏出率無顯著差異，而鋁+空載腺病毒組LDH漏出率明顯增加;與鋁+空載腺病毒組相比，RNAi組LDH漏出率明顯降低，見表1。

正常神經元RNAi組與空載組相比，MTT測定的吸光度值無顯著差異;鋁+空載腺病毒組MTT值明顯降低，COX－2 RNAi+鋁鹽組MTT值明顯上升，見表1。

4 COX-2干擾對海馬神經元病理形態學的影響

轉染空載腺病毒的海馬神經元結構清楚完整，胞體飽滿且胞核清晰，突觸較長，并且相互連結形成網狀結構，細胞數目較多。轉染COX－2 RNA干擾片段進入正常的海馬神經元中，細胞結構依舊完整，細胞數量多，提示單純 COX－2 RNA干擾對神經元無明顯損傷作用。

表1COX－2干擾對海馬神經元SOD活性、MDA含量、LDH漏出率和MTT的影響Table 1.Changes of SOD，MDA，LDH and MTT in primary cultured rat hippocampal neuron(±s.n=6)

表1COX－2干擾對海馬神經元SOD活性、MDA含量、LDH漏出率和MTT的影響Table 1.Changes of SOD，MDA，LDH and MTT in primary cultured rat hippocampal neuron(±s.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs vector－treated group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs vector and aluminium －treated group.

value Vector－ treated 83.83 ±6.00 2.20 ±0.45 18.03 ±Group SOD［103U·(g protein)－1］MDA［μmol·(g proein)－1］LDH(%) A 3.81 0.779 ±0.080 COX －2 RNAi 84.08 ±4.50 2.85 ±0.34 20.20 ±2.43 0.768 ±0.100 Vector and aluminium －treated 46.38 ±4.04＊＊ 4.20 ±0.590＊＊ 39.68 ±4.82 ＊＊ 0.508 ±0.060*COX －2 RNAi and aluminium － treated 70.50 ±2.65## 3.27 ±0.27# 23.38 ±3.50## 0.600 ±0.060#

鋁+空載腺病毒組海馬神經元數量減少，且突起萎縮明顯，并伴有部分死細胞。而轉染了COX－2RNA干擾片段后，神經元突起較為明顯，且能相互連接成網，細胞結構也較為清楚，死細胞較少，見圖2。

Figure 2.Effects of COX －2 RNAi on pathomorphology in primary cultured rat hippocampal neurons(×200).A:vector group;B:COX－2 RNAi group;C:Al+vector group;D:Al+COX－2 RNAi group.圖2 COX-2 RNA干擾對海馬神經元病理形態學的影響

討 論

目前，鋁元素公認可在大腦誘導氧化應激，產生大量自由基，從而誘發神經退行性疾病的發生和發展。許多學者采用鋁鹽進行造模，病理學檢查發現鋁鹽會導致神經元損傷和退變，并發現動物出現了學習記憶功能障礙，神經元細胞凋亡，DNA損傷等表現［9－12］。大量研究成果也表明COX－2的表達與腦損傷、神經元退變密切相關。AD患者腦內Aβ淀粉樣物質水平與COX－2表達的增加具有一致性，臨床上發現AD患者神經纖維纏結的神經元亦是COX－2表達增加的部位，提示COX－2的過表達可能是造成神經元死亡的原因之一［13－14］。進一步研究還提示 COX－2高表達是誘導Aβ淀粉樣物質增加的因素之一［15］，在經典的鋁鹽過負荷導致神經元損傷、退變的模型下，探究COX－2起著怎樣的作用及其之間可能的內在聯系必然會為治療神經損傷和退行性變疾病開拓新的思路，并為開發新的藥物提供可能的理論依據。

本研究發現，與空載腺病毒組相比，單純COX－2 RNAi腺病毒轉染神經元其各項生化酶學指標無明顯的變化，神經元數目正常，細胞形成網狀結構，且胞體飽滿，胞核清晰。而Western blotting檢測結果顯示，其COX－2蛋白表達明顯下降(P＜0.01)，一方面提示COX－2 RNAi腺病毒的轉染神經元是成功的;另一方面，提示RNAi使海馬神經元COX－2的表達適度沉默，并不明顯影響海馬神經元形態和生理功能。我們還發現，COX－2 RNAi能明顯提高鋁鹽負荷海馬神經元細胞存活力和 SOD活性(P＜0.05或 P＜0.01)，降低細胞LDH漏出率和MDA含量(P＜0.05或P＜0.01)，從而減輕了細胞損傷，并一定程度改善鋁負荷神經元病理形態學改變。結果表明，COX－2在神經組織中過表達可能損傷神經元，COX－2 RNA干擾對神經元損傷有明顯的保護作用。

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