人心肌肌球蛋白輕鏈基因啟動子驅動的GFP和Luc報告基因在人心肌細胞系中的表達*

許秀芳， 辛 毅， 汪勁松， 趙莉敏， 杜蘭萍， 葛桂玲，李 娜， 張 穎， 王世強， 黃益民， 羅 毅

(首都醫科大學附屬北京安貞醫院，北京市心肺血管疾病研究所1細胞與分子生物學研究室，3實驗中心，北京100029;2首都醫科大學附屬北京兒童醫院心外科，北京100045;4北京放射醫學研究所，北京100850;5北京大學生命科學學院，北京100871;6北京中醫藥大學電鏡室，北京100029)

肌球蛋白輕鏈2v(myosin light chain 2v，MLC2v)的表達在胚胎心臟發育形成過程中起很重要的作用，MLC2v表達的異常改變將導致心臟缺陷，例如人類心肌病與MLC2v的點突變相關。無論在胚胎發育和出生后的嬰兒發育或成熟期，MLC2v都具有心臟高度特異性。MLC2v基因的啟動子(myosin light chain 2v gene promoter，pMLC2v)是3 kb 的片段，心臟特異性序列位于250 bp內，接近于TATA box［1］。有報道利用心室肌特異的MLC－2v啟動子驅動EGFP，研究了大鼠骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化心室肌細胞的過程，不僅證明轉染pMLC2v-EGFP并不影響大鼠MSCs的生長和向心室肌樣細胞分化的能力，還證明EGFP在MLC－2v啟動子驅動下能特異、有效標記大鼠骨髓MSCs來源心室肌樣活細胞［2］。為了尋找一種能夠示蹤人MSCs分化為心肌細胞的特異性報告基因，本研究擬構建的心肌肌球蛋白輕鏈2v啟動子驅動的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和螢光素酶(luciferase，Luc)報告基因慢病毒載體［3-6］，轉染人心肌細胞系(human cardiomyocyte cell line，HCM)和人肺癌細胞系A549，觀察2種細胞中報告基因的整合表達特征，以及pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc是否具有心肌細胞特異性，為利用多個報告基因同步示蹤實驗動物活體內人MSCs的歸巢、遷移和分化等多個生命特征奠定基礎。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 高糖DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素和鏈霉素均購自Gibco。胰蛋白酶(Sigma)。羊抗人心肌肌鈣蛋白(troponin)I(I抗，Santa Cruz)和FITC標記兔抗羊IgG(Ⅱ抗，Jacson);小鼠抗人肌球蛋白輕鏈單克隆抗體(Abcam)和TRITC標記羊抗鼠抗體IgG(Ⅱ抗，Jacson)。人心肌細胞系HCM和心肌細胞培養基(myocardial cell medium，MCM)購自 ScienCell Research Laboratories。細胞培養板、離心管、培養皿等均購自Corning。

1.2 主要儀器 激光共聚焦顯微鏡(Leica，TCS SP5 MP型)，CO2細胞培養箱(三洋)，高速低溫離心機和酶標檢測儀(Beckman)，生物發光成像系統(IVIS LuminaⅡ型)，細胞電刺激器(北京大學生命科學學院自制)，透射電子顯微鏡(JEM-1230)。

2 方法

2.1 慢病毒載體的包裝與鑒定 參照前期的方法［3］，分別應用pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc質粒，與含有HIV-1病毒gag、pol和rev等基因的pHelper 1.0質粒(編碼病毒主要的結構蛋白)、含有單純皰疹病毒VSVG基因的pHelper 2.0質粒(提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白)構建pMLC2v-GFP或pMLC2v-Luc報告基因慢病毒載體。同時構建非特異性啟動子驅動GFP(common promoter-driven GFP，GFPC)和非特異性啟動子驅動紅色熒光蛋白(common promoter-driven red fluorescent protein，RFPC)報告基因的慢病毒載體。

2.2 pMLC2v-GFP、GFPC和 RFPC轉染 HCM 和 A549細胞

HCM采取如下方法培養:在35 mm共聚焦專用培養皿中加入1 mL MCM培養液，分別將實驗和對照孔中加入1×105個原代HCM細胞，于37℃、5%CO2、95%濕度條件下培養，實驗孔于第2 d換液后分別以pMLC2v-GFP、GFPC單獨轉染和pMLC2v-GFP和RFPC共同轉染，每2 d換液，分別于第 3 d、7 d、14 d、18 d、21 d 后吸出培養液，用 PBS 洗 2 遍，激光共聚焦顯微鏡檢測。對照孔每3 d換液1次，光鏡觀察細胞生長情況。采用RPMI-1640培養基按照常規培養方法培養肺癌細胞系A549，取第2代培養細胞作為對照孔細胞，轉染與檢測步驟同上。

2.3 pMLC2v-Luc轉染 HCM和 A549細胞 24孔板加入MCM培養液，將1×105個細胞加入孔中，于37℃、5%CO2、95%濕度條件下培養，第2 d換液后轉染pMLC2v-Luc，每2 d 換液，分別于第 3 d、7 d、14 d、18 d、21 d 吸出培養液，用 PBS洗2遍，生物發光成像系統定期檢測。肺癌細胞系A549作為對照孔，轉染與檢測步驟同上。

2.4 慢病毒載體轉染報告基因表達的檢測

2.4.1 GFPC、RFPC和 pMLC2v-GFP 表達的熒光成像檢測分別于 GFPC、RFPC和 pMLC2v-GFP報告基因轉染人HCM 和 A549 2 種細胞 3 d、7 d、14 d、18 d、21 d 時，用激光共聚焦顯微鏡觀察。紅色熒光用614 nm、綠色熒光用488 nm的激發波長對不同轉染方式的2種細胞進行細胞斷層掃描和三維圖像合成，并將2種波長的熒光成像相互重疊。分析比較報告基因轉染后，不同細胞中報告基因的表達時相和表達特征。

2.4.2 Luc表達的發光成像檢測 分別于Luc報告基因轉染人 HCM 和 A549 2 種細胞 3 d、7 d、14 d、18 d、21 d 時，用生物發光成像系統檢測2種細胞對Luc的表達。在未轉染報告基因的HCM培養孔中分別加入15 g/L螢光素(Luciferin)100 μL作為陰性對照、加入Luciferase+Luciferin作為陽性對照;在轉染報告基因的HCM培養孔中加入15 g/L熒光素100 μL、不加反應底物作為空白對照。A549細胞的檢測方法相同。

2.5 免疫熒光鑒定人心肌肌鈣蛋白I和MLC2v的表達 取pMLC2v-Luc轉染前和轉染21 d后的HCM和A549細胞接種于鋪有蓋玻片的24孔板中，24 h后PBS洗3次，每次2 min;40 g/L多聚甲醛(pH 7.2)固定40 min，PBS洗3次，每次2 min;3 g/L Triton X-100室溫封閉1 h，PBS洗3次，每次2 min;200 μL 胎牛血清室溫封閉 1 h，取 100 μL 1∶100 稀釋的羊抗人心肌肌鈣蛋白I和小鼠抗人MLC2v單克隆抗體滴到有2種細胞的蓋玻片上，室溫孵育1.5 h，PBS洗3次，每次2 min;分別加入1∶100 FITC標記的兔抗羊抗體IgG和TRITC標記的羊抗鼠抗體IgG，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次2 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞染色情況。

2.6 HCM超微結構鑒定 分別取轉染pMLC2v-Luc前和轉染后表達Luc的HCM，PBS洗3次，每次2 min;2.5%戊二醛固定，包埋，切片，透射電子顯微鏡觀察超微結構。

2.7 HCM興奮-收縮偶聯功能檢測 分別將未轉染報告基因和轉染pMLC2v-GFP的HCM加入2 μmoL/L的Fluo4-AM和2 mmol/L的Ca2+，37℃孵育5 min;于垂直心肌細胞長軸的細胞兩端用白金電極施加10 V、1 Hz、10 ms波寬的脈沖電刺激，激光共聚焦顯微鏡連續觀察記錄人心肌細胞系內的鈣火花和細胞收縮發生情況，每組共觀察10個細胞，檢測人心肌細胞系的興奮-收縮偶聯功能。

3 統計學處理

使用SPSS 12.0統計軟件進行數據處理。數據用均數±標準差(±s)表示，組間的比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HCM轉染GFPC后GFP的表達

激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，HCM的增殖周期約為7 d，培養21 d時，細胞數為原代細胞數的4～5倍，生長狀態良好，顯示培養21 d時有大量新增殖的心肌細胞，可用于長期的實驗觀察，特別是可以進行新生心肌細胞的觀察研究。實驗孔的HCM轉染GFPC后第3 d時表達GFP，表達特征為細胞核和細胞漿中均有較強表達，顯示細胞核、核仁以及部分肌絲的輪廓，見圖1。GFPC可在原代HCM中穩定轉染表達。轉染GFPC的A549細胞也表達GFP(結果未顯示)。

Figure 1.GFP expression in HCM 3 d after transfected with GFPC.A:×100;B:×400.圖1 人心肌細胞系HCM轉染GFPC后第3 d GFP的表達

2 HCM細胞轉染pMLC2v－GFP后表達GFP

HCM轉染pMLC2v-GFP 21 d后表達GFP，見圖2B～D。表達特征為細胞核和細胞漿全細胞表達，可清晰顯示細胞以及細胞核形態。這提示pMLC2v主要在培養21 d后新增殖的心肌細胞中穩定驅動GFP表達，在原代心肌細胞中不表達。轉染pMLC2v-GFP基因的A549細胞不表達GFP，見圖2A。

Figure 2.GFP expression in HCM and A549 cells 21 d after transfected with pMLC2v-GFP.A:A549 cells(×100);B:HCM(×100);C:HCM(×400);D:HCM(×1 000).圖2HCM轉染pMLC2v－GFP后21 d表達GFP

3 pMLC2v－GFP和RFPC慢病毒載體共轉染HCM后表達雙報告基因

pMLC2v-GFP和RFPC共轉染后3 d，HCM表達RFP，表達特征為胞漿中呈顆粒狀較強表達(圖3A)。轉染后21 d，HCM開始表達GFP，表達特征為全細胞表達但以胞漿中表達量稍高(圖3B)。大部分HCM細胞同時表達RFP和GFP，但兩者的表達強度各有不同(圖3C，細胞呈黃色)，部分細胞對2種報告基因均高效表達而呈金黃色，部分細胞RFP表達量較高而呈橘黃色或橘紅色。少量細胞只表達RFP(圖3C，細胞呈紅色)或只表達GFP(圖3C，細胞呈綠色)。這提示RFPC在原代和新增殖HCM中的穩定表達，并不影響pMLC2v-GFP在新增殖心肌細胞中的穩定表達，說明HCM可進行雙報告基因的轉染示蹤。A549細胞在轉染后3 d開始表達RFP，未表達 GFP。

4 HCM轉染pMLC2v－Luc后表達Luc

HCM轉染pMLC2v-Luc后21 d檢測到強的生物發光信號，見圖4E2、F1、F2、F3，說明細胞表達 Luc;而 A549 細胞系并不發光，見圖 4B1、B2、B3、B4。I組:轉染 pMLC2v-Luc的HCM+luciferin發光的平均光通量為(8.43±0.98)×104p·s-1·cm-2·sr-1;Ⅱ組:轉染pMLC2v-Luc的人A549+luciferin發光的平均光通量為(0.27±0.54)×104p·s-1·cm-2·sr-1，2組比較差異顯著(P＜0.01)。這進一步提示pMLC2v驅動Luc只在新增殖的人心肌細胞系中表達，在原代細胞和A549細胞系中不表達，可用于心肌細胞活體生物發光示蹤。

5 表達Luc的HCM免疫熒光染色結果

轉染pMLC2v-Luc前，人HCM的肌鈣蛋白 I和MLC免疫熒光染色均呈陽性，清楚可見胞漿中沿細胞長軸分布的肌絲結構(圖5)，證明本研究采用的原代人心肌細胞系具有典型的正常人心肌細胞結構蛋白成分表型。轉染pMLC2v-Luc 21 d后，表達Luc的HCM仍然表現為肌鈣蛋白I和MLC免疫熒光染色陽性，兩種蛋白分布于胞漿中(圖5)，證明新增殖的心肌細胞仍保持了典型的正常人心肌細胞結構蛋白成分表型。A549細胞系在轉染pMLC2v-Luc前后的肌鈣蛋白I和MLC免疫熒光染色均為陰性。

6 HCM的超微結構

電鏡觀察發現，HCM并沒有正常成人心肌細胞中的肌絲、肌小節和肌絲束間排列的線粒體等典型的超微結構，但多見條索狀內質網和分布不均的線粒體;線粒體的形態正常，但體積明顯小于正常成人心肌線粒體，見圖6。

Figure 3.RFP expression(3 d)and GFP expression(21 d)in HCM after cotransfected with pMLC2v-GFP and RFPC.圖3HCM同時轉染RFPC和pMLC2v－GFP后RFP和GFP的表達

Figure 4.Luc expression in HCM 21 d after transfected with pMLC2v-Luc.F1～3，E2:HCM+pMLC2v-Luc+luciferin;A4:HCM+Luc+luciferin(positive control);C3:HCM+luciferin(negative control);A2:HCM+pMLC2v-Luc(blank control);B1～4:A549+pMLC2v-Luc+luciferin(no luminescence).圖4 HCM轉染pMLC2v－Luc 21 d后Luc的表達

Figure 5.Immunofluorescent staining of HCM before and 21 d after transfected with pMLC2v-Luc.圖5 轉染pMLC2v－Luc前和轉染21 d后HCM的免疫熒光染色

Figure 6.Ultrastructure of HCM under transmission electron microscope.A:no typical myofilaments and sarcomere in HCM;B，C and D:strip-like endoplasmic reticulum and disarranged mitochondia.圖6 透射電鏡觀察HCM的超微結構

7 HCM的興奮－收縮偶聯功能

對轉染pMLC2v-Luc前和轉染21 d后的HCM連續施加10 V、1 Hz、10 ms波寬的脈沖電刺激5 min，既沒有引起細胞內產生鈣火花也沒有引發細胞的收縮或搏動，提示本實驗中無論是原代或新增殖的人心肌細胞系都不具備“興奮-收縮偶聯”功能。同樣，電刺激也沒有引起A549細胞收縮和細胞內出現鈣火花。

討 論

MSCs是一種成體干細胞，具有自我更新和誘導分化潛能，能夠體外定向誘導分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和心肌細胞，甚至可“橫向”分化為神經細胞和神經膠質細胞［7-9］，MSCs在心臟方面的研究主要集中在心肌梗死的治療上［10-14］。近年來，將細胞移植至受損心臟處替代壞死心肌，以修復心肌結構和功能的臨床實驗研究已取得一定進展。一直以來，干細胞改善心功能的作用機制始終是研究的熱點問題。

為了追蹤觀察移植細胞的歸巢、嵌入、分布和分化進程，必須將移植細胞加以標記示蹤，以便于識別和監測。良好的非侵入性示蹤劑探針必須滿足以下要求:(1)無毒;(2)不改變細胞活力、增殖、分化和其它生物活性;(3)不從標記細胞中釋放出來而感染周圍宿主細胞出現假陽性標記;(4)穩定的代謝分解途徑;(5)足夠長的半衰期;(6)能準確地反映標記細胞死亡并實現無創在體檢測，具備較高的分辨率。近年快速發展的生物發光成像技術，是利用轉染Luc報告基因的細胞所表達Luc在活細胞內的O2和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)環境中主動催化螢光素而發出生物可見光，可以穿透5～10 mm組織，具有極低的背景和高靈敏度［15-17］，是活體示蹤細胞功能的首選探針。報告基因GFP和RFP的表達同樣可作為快速反應探針用于指示細胞活性和功能的變化。

在基因表達調控的順式元件中，啟動子就像“開關”一樣發揮著控制基因表達轉錄的起始時間和表達程度的關鍵作用。啟動子對外源基因的表達水平影響很大，要使克隆的報告基因能夠在目的細胞中靶向、高效和長期穩定地表達，啟動子最好是超強的組織特異性啟動子(tissue-specific promoter)［18］。組織特異啟動子又稱器官特異性啟動子。在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達。

成年人心肌肌球蛋白是由2條200 kD的重鏈(MHC)和4條輕鏈(MLC)構成的六聚體，每條MHC分別與1條18～19 kD可磷酸化的調控MLC2和1條28 kD的基礎MLC1連接［19］。心肌肌球蛋白輕鏈MLC-2v的啟動子屬于心肌組織特異性啟動子［20-23］，無論是在胚胎發育期或在出生后的發育成熟期或在心臟代償重塑期［19］，其調控的MLC2v表達都具有心臟高度特異性。在心肌發育期，pMLC2v可被心肌增強因子2(myocyte enhancer factor-2，MEF2)和心臟特異性轉錄因子GATA-4協同激活，正調肌球蛋白輕鏈的基因表達［22］。在人心肌肥厚時，Ca2+-鈣調蛋白-鈣神經素-激活T細胞的細胞核因子(Ca2+-calmodulin-calcineurin-NFAT)信號通路中的Ca2+-鈣調蛋白-鈣調蛋白依賴性激酶(Ca2+-calmodulin-CaMK)使組蛋白去乙酰轉移酶磷酸化，繼而細胞核從組蛋白釋放出活化的MEF2單體，結合到人肌球蛋白輕鏈啟動子的MEF2結合位點。同時，cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的Ser133位點被CaMK IV磷酸化，進而結合到人肌球蛋白輕鏈啟動子的結合位點上［20］。

正常人心室不表達肌球蛋白。因此pMLC2v處于靜默狀態。只有當心肌損傷需要修復或心肌細胞代償重塑或新增殖心肌細胞時，pMLC2v才會被活化，啟動和正調肌球蛋白的翻譯表達。

在本實驗中我們發現，HCM在轉染pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc 21 d后才開始表達報告基因GFP和Luc，這與GFPC和RFPC在第1代細胞內表達的結果明顯不同，說明了pMLC2v是在新增殖的心肌細胞中被激活進而驅動諸如GFP和Luc等外源基因正調表達。這是由于轉染后的pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc整合到第1代心肌細胞核的相應位點，與細胞自有的pMLC2v都處于靜默狀態，當心肌細胞增殖時相關轉錄因子活化pMLC2v，在翻譯肌球蛋白輕鏈2的同時正調兩種報告基因的表達，pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc也隨著細胞增殖被傳到下一代細胞。而A549細胞轉染RFPC后3 d表達RFP但轉染pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc后始終不表達相關報告基因的結果，進一步說明本研究構建的pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc具有心肌細胞特異性。另外，對轉染pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc后的心肌細胞和A549細胞的肌鈣蛋白I和MLC免疫熒光鑒定結果也支持pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc的心肌特異性，因此本研究構建的兩種報告指示載體可用于心肌細胞的增殖、肥大、篩選、干細胞分化心肌細胞的研究。

我們的前期研究證明，人臍帶MSCs、人臍靜脈內皮細胞株Eahy926、人肺癌細胞系A549和大鼠乳鼠心肌細胞同時轉染GFPC和RFPC后，可共表達GFP和RFP，但不同細胞對每種報告基因的表達特征有所不同［4-5］。本研究中人心肌細胞共轉染RFPC和pMLC2v-GFP后可以共表達RFP和GFP，但是表達時相不一致，進一步證明人心肌細胞可以同時轉染表達兩種報告基因，但不同報告基因的表達時相取決于上游啟動子的種類和整合位點。本研究中被轉染的多個報告基因可以同時復制到下一代心肌細胞，不影響細胞的生長和增殖，這為利用不同啟動子驅動多報告基因研究心肌細胞的結構與功能創造了條件。

心肌完整的肌絲結構是心肌收縮的基礎，而豐富的線粒體為細胞收縮提供所需要的能量［24-26］。本研究發現，與正常成年人的心肌細胞超微結構相比較，本實驗采用的人心肌細胞系沒有肌絲結構以及線粒體散在分布且體積較小，證明此細胞系不是真正意義上的“正常成人心肌細胞”，這種異常的超微結構是導致本實驗中的心肌細胞不能被刺激產生興奮-收縮偶聯功能的最主要原因。因此，此類成年人心肌細胞系只能稱為“具有成年人心肌細胞蛋白表型的細胞”，只適合用于對人心肌細胞表型的相關研究，不適合心肌細胞的動力學研究。

本研究利用pMLC2v心肌組織特異性的特點，成功構建了pMLC2v驅動的GFP和Luc報告基因慢病毒載體pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc，并觀測了這兩種報告基因在原代和新增殖人心肌細胞系中的表達特征，為活體內和體外人MSCs分化為心肌細胞進程的研究提供一種特異性的直接實時示蹤工具。我們下一步將從分子水平證實新的心肌細胞合成，并利用心肌細胞pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc報告基因探針動態示蹤人臍帶MSCs在心衰小鼠心臟中分化心肌的潛能和機制，深入探討并具體闡述MSCs治療心衰的作用機理，為解釋MSCs治療心衰的作用機理提供可視熒光和發光的直接證據。

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