吡格列酮對db/db小鼠骨骼肌蛋白酪氨酸磷酸酶1B表達的影響

盧 斌，顧 萍，邵加慶，杜 宏，王 堅

（南京軍區南京總醫院內分泌科，南京 210002）

骨骼肌胰島素抵抗是肥胖和2型糖尿病發生的 重要機制。研究發現蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）負性調節胰島素信號轉導，其表達增加及活性增強可以導致胰島素抵抗的發生。吡格列酮作為胰島素增敏劑改善胰島素抵抗，但其作用機制尚未明確。本研究通過吡格列酮干預來觀察其對db/db小鼠骨骼肌PTP1B表達的影響，探討吡格列酮改善胰島素敏感性的可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組：

C57BL/KsJ db/db小鼠購自美國 Jackson實驗動物中心，并在本院實驗動物中心繁育成功（SCXK［軍］20072012）。實驗期間小鼠在層流柜中飼養，所有器具及食物均消毒，無菌操作。小鼠自由進食、進水，保持墊料干燥，溫度保持在23℃，12 h/12 h亮暗周期。按隨機數字表將小鼠分為吡格列酮組10只和db/db對照組10只，每日固定時間分別給予吡格列酮（艾汀，北京太洋藥業有限公司生產）10 mg/kg體重和相同體積的安慰劑（5％阿拉伯膠）灌胃，連續給藥4周，另選取10只同周齡同窩出生的C57BL/KsJ db/m小鼠給予安慰劑灌胃作為非糖尿病對照組（db/m組）。實驗結束，所有動物麻醉處死取骨骼肌，凍存于-70℃。

1.2 觀察指標

1.2.1 生理生化指標 每周監測小鼠體重和空腹血糖，投藥前和投藥4周后測定空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）。血糖測定使用強生公司生產的One-Touch血糖儀。血清胰島素水平的測定采用小鼠胰島素 ELISA試劑盒（Morinaga，Yokohama， Japan）。胰島素敏感性用 HOMA胰島素抵抗指數（HOMA-IR，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5）來評價。1.2.2 PTP1B蛋白表達的測定 提取骨骼肌蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度，取50 ug蛋白經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉移法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，封閉后加入羊抗鼠PTP1B多克隆抗體（Santa Cruz公司）過夜孵育，洗膜后加入生物素標記的兔抗羊 IgG抗體（Santa Cruz公司）孵育2 h，洗膜后用 ECL增強顯色。同時用同樣方法對上述樣品用抗鼠的β-actin單克隆抗體免疫雜交與顯色作為內參對照。用BioRad Flour-S成像儀將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統進行半定量分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 生理生化指標

4周齡db/db小鼠進入試驗時已表現為肥胖，血糖升高，高胰島素水平，與 db/m組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），而吡格列酮組與db/db對照組小鼠上述指標間差異無統計學意義（P＞0.05）。吡格列酮組小鼠在給予藥物干預 4周后FBG、FINS水平及 HOMA-IR均顯著低于 db/db對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組小鼠的體重及生理、代謝指標比較Tab.1 The comparison of weight，physiological and metabolic parameters

2.2 Westernblot檢測PTP1B蛋白表達

應用WB檢測各組小鼠骨骼肌PTP1B蛋白的表達，結果顯示，db/db組小鼠骨骼肌 PTP1B表達顯著高于db/m組（P＜0.05），給予吡格列酮干預4周后，吡格列酮組db/db小鼠骨骼肌PTP1B表達水平較 db/db對照組顯著降低（P ＜0.05）（圖1）。

3 討論

db/db小鼠是一種先天肥胖性2型糖尿病小鼠模型，由于瘦素受體基因發生突變所致。一般于出生后3～4周即可表現為肥胖，血糖升高，胰島素抵抗等特性，是研究2型糖尿病的理想模型。本研究中4周齡db/db小鼠表現為高血糖、體重增加，胰島素抵抗指數增加，與對照組相比有顯著性差異。

圖1 圖1 各組小鼠骨骼肌PTP1B蛋白表達量Fig.1 PTP1B protein expression in muscle of each group

肥胖、胰島素抵抗的機制目前尚未完全闡明。研究發現胰島素信號轉導受到正負調節蛋白的協同作用，而在眾多負調節因子中PTP1B作用突出。PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一員，在人體多種組織細胞中普遍存在，主要位于胞漿內質網表面，它通過使激活的胰島素受體及胰島素受體底物等去磷酸化失活而發揮生理功能［1］。研究發現PTP1B的表達水平在糖尿病或發生胰島素抵抗時明顯升高。在嚙齒類糖尿病動物的骨骼肌和脂肪細胞中，PTP1B的表達和活性均顯著升高［2］。PTP1B基因敲除小鼠，與野生型小鼠相比，其胰島素敏感性增強，肝臟及肌肉組織中的胰島素受體磷酸化水平升高，該小鼠即使在致肥胖飲食條件下也不出現肥胖或胰島素抵抗［3］。這些研究提示PTP1B是胰島素信號轉導的負性調節者，PTP1B也就成為胰島素抵抗機制研究的重要位點［4］。

吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物（thiazolidilsdioms，TZDs），作為胰島素增敏劑，能有效降低2型糖尿病患者血糖和血漿胰島素水平，提示該藥不刺激胰島素的分泌，而是通過增強機體對胰島素的敏感性達到降低血糖的效果。目前認為其主要作用機制是通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor -γ，PPARγ），調節某些參與葡萄糖和脂肪酸代謝的胰島素反應性基因的轉錄［5］。吡格列酮如何改善骨骼肌胰島素敏感性具體機制目前還不確切，本研究對此進行初步探討。PPARγ在骨骼肌表達量很低，只有脂肪組織表達量的10％［6］，因此以往認為脂肪組織是吡格列酮的主要作用位點，而骨骼肌胰島素作用改善是由于下調脂質水平及減少葡萄糖脂肪循環引起的。然而骨骼肌胰島素敏感性改善非常明顯，而且TZD類藥物可以在成熟的骨骼肌細胞L6增加葡萄糖轉運［7］。TZD類藥物是否通過PPAR非依賴途徑增加肌肉胰島素敏感性?

本研究用db/db糖尿病小鼠模型，觀察吡格列酮對其骨骼肌中PTP1B表達的影響，探討吡格列酮改善骨骼肌胰島素抵抗的分子機制。由于PTP1B是一種胞內蛋白，目前還沒有定量檢測的方法，所以我們采用Western blot進行半定量蛋白檢測。實驗證實在胰島素抵抗狀態下，db/db小鼠骨骼肌PTP1B蛋白表達明顯增加。經吡格列酮處理4周后db/db小鼠血糖下降，胰島素抵抗明顯改善，同時伴隨著骨骼肌PTP1B水平的下降。這提示PTP1B可能與吡格列酮改善骨骼肌胰島素敏感性有關。因此吡格列酮可能是通過減少PTP1B表達從而增加骨骼肌胰島素敏感性。但仍需大量進一步體外研究來證實該作用。下一步通過體外試驗研究吡格列酮對骨骼肌細胞PTP1B表達的影響及應用PTP1B激動劑或抑制劑進行干預，這有助于研究PTP1B在胰島素抵抗中的作用及吡格列酮作用機制。

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