乳酸菌在體外模擬胃腸環(huán)境中的抗性研究及其發(fā)酵特性

程秀芳，王叢叢，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

益生菌對健康的有益作用最早是由俄國科學家Metchnikoff提出的，他認為腸道乳酸菌能夠通過防止腐敗菌的生長而起到延長壽命的作用.益生菌是指具有生物活性的，攝入適當量時可以對宿主產(chǎn)生有益作用的微生物［1］.近年來，越來越多的學者認識到腸道菌群對人類健康的重要性，以及膳食成分對腸道菌群的有益調(diào)節(jié)作用.益生菌的保健功能逐漸被人們認可，這些功能包括：調(diào)節(jié)腸道菌群，預防胃腸道感染、抗腫瘤［2］、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)以及降膽固醇［3］等方面.益生菌對人體健康的有益作用人所共知，但是益生菌在自然界中的存活率較低：在經(jīng)過消化道時，由于胃液和膽汁的作用，大多數(shù)益生菌的活性幾乎喪失殆盡，而只有活著的乳酸菌才能表現(xiàn)出很好的保健功能，因此，篩選優(yōu)良的能夠耐受人體胃腸環(huán)境的益生菌是技術人員研究的重點.以前的研究表明，不是所有的乳酸菌都能耐受低pH和高濃度的膽鹽環(huán)境，僅有少數(shù)乳酸菌具有這種能力［4］.目前，很多國家正對乳酸菌的選育工作進行深入研究，但在國內(nèi)報道的還較少.本課題旨在從公司研究院保存的8株乳酸菌菌株中篩選耐酸、耐膽鹽，并能夠耐受人工胃液和人工腸液的菌株，以給生產(chǎn)乳酸菌制品的生產(chǎn)廠家提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗菌種 BL67、BLLP、BL71、BL55、BLL26、SH33、BJLY、BLR3（山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存）.

1.2 試劑 豬膽鹽（生化試劑）、吐溫－80、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、醋酸鈉、檸檬酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（中國天津巴斯夫化工有限公司）.

1.3 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基.

1.4 試驗方法

1.4.1 形態(tài)特征及生理、生化特性鑒定 將8株菌分別在MRS培養(yǎng)基斜面上活化2～3次，在無菌條件下，用接種環(huán)劃2環(huán)接種于液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，鏡檢，并用酸度計分別測定pH值.形態(tài)特征鑒定見表1，pH值結(jié)果見表2.

1.4.2 耐酸試驗 人體空腹胃液的pH值在0.9～1.5之間，飯后胃液的pH值在3.5以上，通過大量的試驗證實，乳酸菌在飯后胃液pH3.5以上都能存活，因此本試驗耐酸的指標定于1.5.又因為食物過胃的時間較短，一般是1～2 h［7～9］，在空腹胃液中能夠存活1h的，被認為能夠耐受餐后胃液，因此本試驗的培養(yǎng)時間為1h.

試驗方法：用HCl將生理鹽水的pH值調(diào)為1.5，滅菌30min.將液體種子以1%（v／v）的接種量轉(zhuǎn)入其中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)1h，取樣，平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，以液體種子作為對照，將活菌數(shù)取對數(shù)，結(jié)果見表3.

1.4.3 耐膽鹽試驗 人體小腸中膽鹽的含量在0.03%～0.3%之間，故采用0.3%的膽鹽作為篩選耐受腸道內(nèi)膽鹽的指標［5］，在培養(yǎng)基中添加豬膽鹽使其濃度為0.3%，滅菌30 min，將液體種子以2%（v／v）的接種量轉(zhuǎn)入其中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)3h，取樣，平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，以液體種子作為對照，將活菌數(shù)取對數(shù)，結(jié)果見表5.

1.4.4 模擬人工胃液試驗 人工胃液的配置依照《中國藥典》2010年版附錄［6］.液體種子以2%（v／v）的接種量接種于人工胃液中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)，分別在0.5h、1h、2h、3h取樣，平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，以液體種子作為對照，將活菌數(shù)取對數(shù)，結(jié)果見表4.

1.4.5 模擬人工腸液試驗 人工腸液配置依照《中國藥典》2010年版附錄［6］.液體種子以2%（v／v）的接種量接種于人工腸液中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)，分別在0h、2h、4h、6h、8h取樣，平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，以液體種子作為對照，將活菌數(shù)取對數(shù)，結(jié)果見表6.

1.4.6 發(fā)酵特性研究 用平板計數(shù)法測定菌株BLL26在脫脂乳中37℃培養(yǎng)48h過程中的活菌數(shù)，并測定pH值，結(jié)果見圖1.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征鑒定

表1 乳酸菌的形態(tài)學結(jié)果

續(xù)表1：

2.2 培養(yǎng)24h后發(fā)酵液的pH值

表2 培養(yǎng)24h后發(fā)酵液的pH值（lgCFU?mL－1）

由表2可以看出：以菌株BLL26發(fā)酵液的pH值最低為3.75，其次是sh33和BL71，pH值都在4以下，說明這三株菌的產(chǎn)酸能力較強.

2.3 耐酸試驗

表3 耐酸試驗結(jié)果（lgCFU?mL－1）

由表3可以看出：菌株BLL26的耐酸能力最強，在pH 1.5的酸性溶液中1h其存活率為5.38%（10－1.27），其次是菌株BLR3存活率為1.82%（10－1.74），其余幾株菌存活的較少，說明在這兩株菌耐受酸的能力比較強.

2.4 耐人工胃液試驗

表4 耐受人工胃液試驗結(jié)果（lgCFU?mL－1）

由表4可以看出：8株菌在人工胃液中只有菌株BLL26能夠耐受，3h后活菌數(shù)存活率為0.79‰（10－3.1），其余7株菌死亡率較高.30min后，菌株BLL26沒有死亡現(xiàn)象，菌株BLLP、BL71的存活率為0.23‰（10－3.63）、0.11‰（10－3.94），而BL67、BL55的存活率更低.3h后，菌株BLL26活菌數(shù)的數(shù)量級為106，在空腹胃液pH值1.5 1h能夠存活，因此在餐后胃液pH值3以上存活率會更高.以上結(jié)果說明，菌株BLL26能夠耐受胃酸的能力較強.

2.5 耐膽鹽試驗

表5 耐膽鹽試驗結(jié)果（lgCFU?mL－1）

由表5可以看出：菌株BLL26、菌株BL71在膽鹽溶液中培養(yǎng)3h后，活菌數(shù)存活率較高，分別是58.9%（10－0.23）、43.7%（10－0.36），說明這兩株菌耐膽鹽能力較強；而菌株BJLY、SH33在膽鹽溶液中活菌數(shù)存活的較少，分別是0.24‰（10－3.72）和0.47‰，這兩株菌耐膽鹽能力較弱.

2.6 耐人工腸液試驗

表6 耐受人工腸液試驗結(jié)果（lgCFU?mL－1）

由表6可以看出：8株菌在人工腸液中6h存活率都很高，其中菌株BL71、BLL26、BL67、BLLP四株菌比0h的活菌數(shù)增加，說明這四株菌能夠在腸液中存活并生長，BL55、BJLY、SH33、BLR3四株菌活菌數(shù)下降，其中以BLR3活菌數(shù)下降的最多.

2.7 菌株BLL26在脫脂乳中37℃培養(yǎng)48h過程中的pH值和活菌數(shù)對數(shù)值的變化 由圖1可以看出：菌株BLL26在0～2h生長比較緩慢，活菌數(shù)增長較慢，為延緩期，2～6h活菌數(shù)增長最快，活菌數(shù)的對數(shù)基本呈直線，為對數(shù)生長期，在12h活菌數(shù)達到最高，為穩(wěn)定期，直至48h活菌數(shù)并未減少，可能因為菌株BLL26能夠耐酸，活菌數(shù)目受pH值影響較小.pH值在2～12h迅速下降，12h后pH值下降比較平緩，48hpH值下降為3.3，說明此株菌產(chǎn)酸能力較強，使發(fā)酵液的pH值較低.由此看出此菌株發(fā)酵對數(shù)期較短，適宜酸乳的工業(yè)化發(fā)酵.

圖1 菌株BLL26在脫脂乳中培養(yǎng)48hpH值和活菌數(shù)對數(shù)值的變化曲線

3 討論

通過8株乳酸菌的耐酸、耐膽鹽能力比較，可知菌株BLL26能夠耐酸和耐膽鹽，并且菌株BLL26在人工胃液中3 h數(shù)量級為106，在人工腸液中6h數(shù)量級為109，能夠存活，說明菌株BLL26能夠耐受人體胃腸道環(huán)境.通過其生長曲線的研究表明，此菌株生長周期較短，是一株很好的生產(chǎn)酸乳的菌株.而至于此菌株的其他特性，如抑菌性、耐藥性以及其他功能等還要進一步進行研究.

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