苦瓜多糖提取工藝的考察與優(yōu)化

楊 稅，張雅琴，孫 鋒，張學(xué)農(nóng)

(1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州215123;2.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州215009)

苦瓜為葫蘆科苦瓜屬植物，是人們生活中的一種很常見的蔬菜，同時(shí)也是功能食品的原料，素有“藥用蔬菜”之稱。苦瓜味苦性寒，無毒，其根、莖、葉、花、果實(shí)和種子在世界各地均有藥用記載，《本草綱目》記載苦瓜有清火明目、解毒、降血糖、滋養(yǎng)、益氣的功效［1，2］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［3］，通過沸水提取、醇析、脫蛋白和透析，可以從鮮苦瓜中分離出多糖粗品，這種多糖稱為苦瓜多糖(Momordica charantia polysaccharide，簡稱MCP)，是一種由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，具有水溶性，能提高免疫力、降血糖、抑菌、抗氧化等，是苦瓜中主要生物活性成分之一。

鑒于苦瓜多糖的多種功效及苦瓜的藥用價(jià)值，本文以苦瓜為原料，通過綜合影響提取的單因素和多因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，考察其最佳的提取條件，并建立新的優(yōu)化工藝，以提高苦瓜多糖的提取效率。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SHZ－D循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市英峪豫華儀器廠);112GKC控溫水浴鍋(上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);MS－DS10A1豆?jié){機(jī)(廣東省精品電器制造有限公司); TU－1800紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 材料和試劑 苦瓜:市售，來自蘇州蔬菜農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。無水乙醇、常用水、葡萄糖、濃硫酸以及蒽酮試劑等。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝的流程 挑選飽滿苦瓜去籽去瓤，洗凈切片后分別稱取苦瓜100 g，按實(shí)驗(yàn)要求加入一定量的水進(jìn)行勻漿，將苦瓜漿倒入不同規(guī)格的圓底燒瓶中，分別加入3 g超濾酶和1 g果膠酶，搖勻，浸提一定時(shí)間后冷卻，直至常溫，抽濾，殘?jiān)^續(xù)加水10 mL保持原條件浸提2次，再次過濾，合并濾液，并濃縮至約50 mL，冷卻后加入木瓜蛋白酶1 g，搖勻后45℃恒溫1 h，冷卻至常溫加入5倍體積的無水乙醇，搖勻密封后放置冰箱48 h，過濾收集沉淀，在50℃烘箱中放置12 h，得到苦瓜多糖產(chǎn)品，稱重，最后進(jìn)行苦瓜多糖的含量測(cè)定。

2.2 影響因素考察 以苦瓜漿為原料，采用熱水浸提、乙醇醇析的方法提取苦瓜多糖，影響苦瓜多糖提取的主要因素有:浸提溫度、時(shí)間、水料比、乙醇沉淀濃度、酶的選擇和用量等。因此，本實(shí)驗(yàn)以浸提溫度、水料比、浸提時(shí)間為3個(gè)考察因素，通過綜合提取效率的單因素變化規(guī)律和多因素的相互干擾以確定最終的試驗(yàn)條件。

2.2.1 浸提溫度的影響 固定水料比為1∶1、浸提時(shí)間為3 h，浸提溫度分別以60、80、100、120℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖1。

圖1 產(chǎn)量與浸提溫度關(guān)系圖

2.2.2 浸提時(shí)間的影響 條件:固定溫度為60℃、水料比為1、浸提時(shí)間分別以1、3、5、7 h進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2。

圖2 產(chǎn)量與浸提時(shí)間關(guān)系圖

2.2.3 水料比的影響 條件:固定浸提溫度為60℃、浸提時(shí)間為3 h，水料比分別以1(1∶1)、5、10、20進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3。

圖3 產(chǎn)量與水料比的關(guān)系圖

由圖1、圖2和圖3可見，苦瓜多糖產(chǎn)量與浸提溫度、浸提時(shí)間以及水料比有密切的關(guān)系，通過曲線的變化規(guī)律可看出產(chǎn)量隨浸提溫度升高先增大然后漸漸平緩并向下的趨勢(shì);產(chǎn)量隨浸提時(shí)間的增加有先降低后漸漸平緩并有略微向上的趨勢(shì)，但變化不大;而產(chǎn)量隨水料比的增加先平緩略微向下后上升再趨于平穩(wěn)。所以根據(jù)單因素的影響以及實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作的可行性角度出發(fā)，除空白列外另選三因素:浸提溫度、浸提時(shí)間和水料比，同時(shí)各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(3)正交試驗(yàn)［4］，其中:浸提溫度取60、80、100℃;水料比取1、5、10;浸提時(shí)間取1、2、3 h;通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定確定苦瓜多糖的提取率及其多糖含量。具體的設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟 根據(jù)試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表按照優(yōu)化后提取工藝的流程分別進(jìn)行試驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 苦瓜多糖的產(chǎn)量 通過L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表按照優(yōu)化后提取工藝的流程進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

3.2 苦瓜多糖含量測(cè)定

3.2.1 原理及方法 苦瓜多糖的含量測(cè)定通常依靠糖類物質(zhì)的特征顏色反應(yīng)。常用的試劑很多，就反應(yīng)的化學(xué)過程來說，可以概括為兩種不同的類型:①用非氧化性酸(硫酸或鹽酸)使糖類脫水形成呋喃醛類衍生物，進(jìn)一步與酚類或含氮堿縮合生成有色物質(zhì);②用堿處理糖類，產(chǎn)生復(fù)雜的裂解衍生物，即運(yùn)用與某些試劑作用，呈現(xiàn)特殊顏色。目前常用的多糖含量測(cè)定方法為蒽酮－硫酸法，是以第一類原理為基礎(chǔ)，利用多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，單糖進(jìn)一步脫水成糖醛，糖醛與蒽酮直接結(jié)合生成藍(lán)綠色衍生物，該衍生物在620nm處出現(xiàn)最大吸收。該操作具有簡單、快速、試驗(yàn)現(xiàn)象穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好等優(yōu)點(diǎn)［5］。本實(shí)驗(yàn)中以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用蒽酮－硫酸法分析測(cè)定苦瓜多糖的含量。

3.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取9支帶塞磨口試管，用濃度為0.5 g·L－1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制含糖量(mg· mL－1)為0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22的葡萄糖溶液。稱取0.33 g蒽酮，加100 mL濃硫酸，置于棕色瓶中，搖勻。分別移取1 mL系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于磨口試管中，同時(shí)以1 mL蒸餾水作空白，每管加入4.00 mL蒽酮－硫酸試劑，立即搖勻，置于冰水浴中，然后置于沸水浴中加熱10 min，用自來水冷卻，室溫放置10 min，于620 nm處測(cè)定吸光度。并且以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］(圖4)。

3.2.3 苦瓜多糖含量測(cè)定與分析 分別取1 mg浸提產(chǎn)品分別標(biāo)號(hào)定量至1 mL，測(cè)量其吸光度;結(jié)果如下:

圖4 吸光度與糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 多糖含量、多糖量與吸光度的關(guān)系

將表3中的苦瓜多糖產(chǎn)品量以及苦瓜多糖含量代人L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行分析，推導(dǎo)出優(yōu)化工藝中的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

表4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表5 L9(34)正交試驗(yàn)方差分析表

通過L9(3)正交試驗(yàn)表結(jié)果和方差分析表確定影響多糖提取率的因素B(浸提溫度)、因素C(水料比)、因素D(浸提時(shí)間)的主次關(guān)系，結(jié)果如下:①由極差R值大小分析結(jié)果為RD＞RC＞RB，即影響產(chǎn)品產(chǎn)率的因素主次順序:D＞C＞B;②根據(jù)顯著性可知:FD＞FC＞FB，影響產(chǎn)品產(chǎn)率的因素主次順序:D＞C＞B。由此可見，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析都得出影響產(chǎn)品產(chǎn)率的因素主次順序?yàn)镈＞C＞B。同時(shí)，每個(gè)因素在不同水平上對(duì)多糖提取率的影響程度分別為D1＞D2＞D3，C3＞C1＞C2，B2＞B3＞B1［7］，所以，苦瓜多糖提取率的最優(yōu)水平搭配為D1C3B2，即時(shí)間為1 h、水料比為10∶1、浸提溫度為80℃。此時(shí)的苦瓜多糖產(chǎn)品的提取率為3.3%，多糖含量為23.2%，這也與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

4 結(jié)論

苦瓜多糖的提取方法到目前為止已有很多，近期研究比較多的運(yùn)用苦瓜干進(jìn)行提取比如有常規(guī)法、超聲波提取法、微波萃取法等［8］。而本試驗(yàn)通過運(yùn)用苦瓜漿，采用酶解法提取水溶性苦瓜多糖，工藝步驟少，試驗(yàn)條件溫和，減少了苦瓜中有效成分的損耗，同時(shí)多糖的產(chǎn)量與含量也有所提高，本實(shí)驗(yàn)通過工藝的優(yōu)化也為以后苦瓜多糖提取的進(jìn)一步探索提供了一些依據(jù)。

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［4］ 王欽德，楊堅(jiān).食品試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003:85－120.

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