苦瓜多糖提取工藝的考察與優化

楊 稅，張雅琴，孫 鋒，張學農

(1.蘇州大學藥學院，江蘇蘇州215123;2.蘇州衛生職業技術學院，江蘇蘇州215009)

苦瓜為葫蘆科苦瓜屬植物，是人們生活中的一種很常見的蔬菜，同時也是功能食品的原料，素有“藥用蔬菜”之稱。苦瓜味苦性寒，無毒，其根、莖、葉、花、果實和種子在世界各地均有藥用記載，《本草綱目》記載苦瓜有清火明目、解毒、降血糖、滋養、益氣的功效［1，2］。據文獻報道［3］，通過沸水提取、醇析、脫蛋白和透析，可以從鮮苦瓜中分離出多糖粗品，這種多糖稱為苦瓜多糖(Momordica charantia polysaccharide，簡稱MCP)，是一種由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，具有水溶性，能提高免疫力、降血糖、抑菌、抗氧化等，是苦瓜中主要生物活性成分之一。

鑒于苦瓜多糖的多種功效及苦瓜的藥用價值，本文以苦瓜為原料，通過綜合影響提取的單因素和多因素設計實驗，考察其最佳的提取條件，并建立新的優化工藝，以提高苦瓜多糖的提取效率。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SHZ－D循環水式真空泵(河南鞏義市英峪豫華儀器廠);112GKC控溫水浴鍋(上海蘇達實驗儀器有限公司);MS－DS10A1豆漿機(廣東省精品電器制造有限公司); TU－1800紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 材料和試劑 苦瓜:市售，來自蘇州蔬菜農貿市場。無水乙醇、常用水、葡萄糖、濃硫酸以及蒽酮試劑等。

2 方法與結果

2.1 提取工藝的流程 挑選飽滿苦瓜去籽去瓤，洗凈切片后分別稱取苦瓜100 g，按實驗要求加入一定量的水進行勻漿，將苦瓜漿倒入不同規格的圓底燒瓶中，分別加入3 g超濾酶和1 g果膠酶，搖勻，浸提一定時間后冷卻，直至常溫，抽濾，殘渣繼續加水10 mL保持原條件浸提2次，再次過濾，合并濾液，并濃縮至約50 mL，冷卻后加入木瓜蛋白酶1 g，搖勻后45℃恒溫1 h，冷卻至常溫加入5倍體積的無水乙醇，搖勻密封后放置冰箱48 h，過濾收集沉淀，在50℃烘箱中放置12 h，得到苦瓜多糖產品，稱重，最后進行苦瓜多糖的含量測定。

2.2 影響因素考察 以苦瓜漿為原料，采用熱水浸提、乙醇醇析的方法提取苦瓜多糖，影響苦瓜多糖提取的主要因素有:浸提溫度、時間、水料比、乙醇沉淀濃度、酶的選擇和用量等。因此，本實驗以浸提溫度、水料比、浸提時間為3個考察因素，通過綜合提取效率的單因素變化規律和多因素的相互干擾以確定最終的試驗條件。

2.2.1 浸提溫度的影響 固定水料比為1∶1、浸提時間為3 h，浸提溫度分別以60、80、100、120℃進行試驗，結果如圖1。

圖1 產量與浸提溫度關系圖

2.2.2 浸提時間的影響 條件:固定溫度為60℃、水料比為1、浸提時間分別以1、3、5、7 h進行試驗，結果如圖2。

圖2 產量與浸提時間關系圖

2.2.3 水料比的影響 條件:固定浸提溫度為60℃、浸提時間為3 h，水料比分別以1(1∶1)、5、10、20進行試驗，結果如圖3。

圖3 產量與水料比的關系圖

由圖1、圖2和圖3可見，苦瓜多糖產量與浸提溫度、浸提時間以及水料比有密切的關系，通過曲線的變化規律可看出產量隨浸提溫度升高先增大然后漸漸平緩并向下的趨勢;產量隨浸提時間的增加有先降低后漸漸平緩并有略微向上的趨勢，但變化不大;而產量隨水料比的增加先平緩略微向下后上升再趨于平穩。所以根據單因素的影響以及實驗的實際操作的可行性角度出發，除空白列外另選三因素:浸提溫度、浸提時間和水料比，同時各取3個水平，進行L9(3)正交試驗［4］，其中:浸提溫度取60、80、100℃;水料比取1、5、10;浸提時間取1、2、3 h;通過實驗測定確定苦瓜多糖的提取率及其多糖含量。具體的設計見表1。

表1 試驗因素水平設計表

2.3 實驗步驟 根據試驗因素水平設計表按照優化后提取工藝的流程分別進行試驗。

3 實驗結果

3.1 苦瓜多糖的產量 通過L9(34)正交試驗設計表按照優化后提取工藝的流程進行試驗，試驗結果見表2。

表2 正交設計試驗結果

3.2 苦瓜多糖含量測定

3.2.1 原理及方法 苦瓜多糖的含量測定通常依靠糖類物質的特征顏色反應。常用的試劑很多，就反應的化學過程來說，可以概括為兩種不同的類型:①用非氧化性酸(硫酸或鹽酸)使糖類脫水形成呋喃醛類衍生物，進一步與酚類或含氮堿縮合生成有色物質;②用堿處理糖類，產生復雜的裂解衍生物，即運用與某些試劑作用，呈現特殊顏色。目前常用的多糖含量測定方法為蒽酮－硫酸法，是以第一類原理為基礎，利用多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，單糖進一步脫水成糖醛，糖醛與蒽酮直接結合生成藍綠色衍生物，該衍生物在620nm處出現最大吸收。該操作具有簡單、快速、試驗現象穩定、重現性較好等優點［5］。本實驗中以葡萄糖作為標準品，采用蒽酮－硫酸法分析測定苦瓜多糖的含量。

3.2.2 葡萄糖標準曲線繪制 取9支帶塞磨口試管，用濃度為0.5 g·L－1葡萄糖標準溶液分別配制含糖量(mg· mL－1)為0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22的葡萄糖溶液。稱取0.33 g蒽酮，加100 mL濃硫酸，置于棕色瓶中，搖勻。分別移取1 mL系列葡萄糖標準溶液于磨口試管中，同時以1 mL蒸餾水作空白，每管加入4.00 mL蒽酮－硫酸試劑，立即搖勻，置于冰水浴中，然后置于沸水浴中加熱10 min，用自來水冷卻，室溫放置10 min，于620 nm處測定吸光度。并且以吸光度為縱坐標，葡萄糖的含量為橫坐標，繪制標準曲線［6］(圖4)。

3.2.3 苦瓜多糖含量測定與分析 分別取1 mg浸提產品分別標號定量至1 mL，測量其吸光度;結果如下:

圖4 吸光度與糖含量的標準曲線

表3 多糖含量、多糖量與吸光度的關系

將表3中的苦瓜多糖產品量以及苦瓜多糖含量代人L9(34)正交試驗表進行分析，推導出優化工藝中的最佳實驗條件。

表4 正交設計試驗結果

表5 L9(34)正交試驗方差分析表

通過L9(3)正交試驗表結果和方差分析表確定影響多糖提取率的因素B(浸提溫度)、因素C(水料比)、因素D(浸提時間)的主次關系，結果如下:①由極差R值大小分析結果為RD＞RC＞RB，即影響產品產率的因素主次順序:D＞C＞B;②根據顯著性可知:FD＞FC＞FB，影響產品產率的因素主次順序:D＞C＞B。由此可見，根據正交實驗結果和方差分析都得出影響產品產率的因素主次順序為D＞C＞B。同時，每個因素在不同水平上對多糖提取率的影響程度分別為D1＞D2＞D3，C3＞C1＞C2，B2＞B3＞B1［7］，所以，苦瓜多糖提取率的最優水平搭配為D1C3B2，即時間為1 h、水料比為10∶1、浸提溫度為80℃。此時的苦瓜多糖產品的提取率為3.3%，多糖含量為23.2%，這也與實驗結果相符。

4 結論

苦瓜多糖的提取方法到目前為止已有很多，近期研究比較多的運用苦瓜干進行提取比如有常規法、超聲波提取法、微波萃取法等［8］。而本試驗通過運用苦瓜漿，采用酶解法提取水溶性苦瓜多糖，工藝步驟少，試驗條件溫和，減少了苦瓜中有效成分的損耗，同時多糖的產量與含量也有所提高，本實驗通過工藝的優化也為以后苦瓜多糖提取的進一步探索提供了一些依據。

［1］ 田亞維.苦瓜的研究概述［J］.醫學信息，2002，10 (15):619－620.

［2］ 陳紅琳.苦瓜的藥理作用［J］.中華醫學寫作雜志，2002，9(18):1504－1505.

［3］ 程霜，崔慶新，王勇.水溶性苦瓜多糖的提取與測定［J］.鄭州糧食學院學報，2000，21(2):53－56.

［4］ 王欽德，楊堅.食品試驗設計與統計分析［M］.北京:中國農業大學出版社，2003:85－120.

［5］ 高曉明.苦瓜有效成分的提取、純化工藝研究［D］.西安:西北大學，2006.

［6］ 謝建華，謝明勇，聶少平，等.青錢柳中多糖的測定［J］.分析試驗室，2007，26(8):32－36.

［7］ 劉金福，張平平，趙鑫，等.苦瓜多糖提取工藝的研究［J］.天津農學院學報，2003，10(3):30－34.

［8］ 鐘正.苦瓜多糖研究綜述［J］.廣東化工，2011，38(2): 91－92.