HPLC法測定維生素C片含量

蔣江云

(三明市藥品檢驗所，福建三明365000)

維生素C是人體膠原蛋白形成所必需的，它有助于保持結締組織、骨樣組織以及牙本質的完整，維生素C的缺乏可導致齒齦腫脹、出血，皮下淤點等，臨床中經常需要給患者進行維生素C補充和治療。維生素C片收載于《中國藥典》2010年版［1］，其含量測定采用碘量法。碘量法測定時在判斷滴定終點時可能產生人為的誤差，且新版藥典中碘滴定液的標定改用硫代硫酸鈉反標，增加了移液和判斷滴定終點的二重誤差。維生素C在含水介質中，由于受光、空氣、溫度和pH影響，樣品溶液不穩(wěn)定使測定結果不理想。本文以二巰基丙烷磺酸鈉(DMPS)62.5 mg·mL－1為抗氧劑［2］，以磷酸鹽緩沖液pH(6.0±0.1)為溶劑，可使樣品處于初始狀態(tài)，建立HPLC法測定維生素C的含量。該方法操作簡便，專屬性強，干擾少，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，結果準確。本實驗同時用碘量法進行含量測定，對兩種方法進行比較，測定結果相近，說明建立的HPLC法可作為維生素C片的含量測定和質量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司);色譜柱為 Hypersil ODS C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);Cary－50紫外可見分光光度計(美國瓦里安); DELTA－320精密pH計(瑞士梅特勒一托利多酸度計); BP211D電子天平(德國賽多利斯);德國BRAND單道可調移液器(規(guī)格分別為20～200 μL、500～5 000 μL)。

1.2 試藥 維生素C對照品(中檢所，批號:100425－200702，含量:100.0%，規(guī)格:100 mg，供含量測定用);維生素C片(福建省三明天泰有限公司，規(guī)格:100 mg/片，批號20111001，編號01);維生素C片(四川省三星堆制藥有限公司，規(guī)格:100 mg/片，批號:110402，編號02);維生素C片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，規(guī)格:100 mg/片，批號: 100932，編號03);2，3－二巰基丙烷磺酸鈉(美國阿法埃莎，純度:95%);甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司);其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS C18柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm);流動相為磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鉀4 g與磷酸二氫鉀16 g，加煮沸過的冷水溶解并稀釋至2 000 mL，pH調節(jié)至6.0±0.1)－甲醇(95∶5);柱溫為室溫;流速為1.0 mL·min－1;檢測波長266 nm;進樣量20 μL。

2.2 標準曲線的制備 精密稱取維生素C對照品24.58 mg置25 mL棕色容量瓶，加DMPS溶液25 μL，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)溶解并稀至刻度，得約1 mg·mL－1的標準貯備液，避光保存。精密量取標準貯備液各0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL分置100 mL棕色量瓶，各加入DMPS溶液100 μL，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)稀至刻度，得濃度分別約為5、10、15、20、25、30 μg·mL－1的溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，(Y)對相應的濃度(X)進行線性回歸，從而得到維生素C的標準曲線方程為:Y=99.984 5X－0.004 0(r=1.000 0，n=6)。結果表明維生素C進樣量在5～30 μg·mL－1范圍內，呈良好的線性關系，符合外標法定量測定的要求。

2.3 供試品溶液的制備 取編號01的供試品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于維生素C 50 mg)置50 mL棕色量瓶，加入DMPS溶液50 μL，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)溶解并稀至刻度，搖勻，即得約1 mg·mL－1的供試品溶液，濾過;取續(xù)濾液2 mL置100 mL棕色量瓶，加入DMPS溶液100 μL，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)溶解并稀至刻度，搖勻，即得20 μg·mL－1的供試品溶液。

2.4 測定法 分別精密吸取濃度為20 μg·mL－1的對照品溶液、供試品溶液及依比例加入DMPS溶液的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)20 μL，按上述色譜條件進樣分析，理論板數(shù)以維生素C的色譜峰計達6 700，符合液相色譜條件，結果見圖1。

2.5 精密度試驗 精密吸取25 μg·mL－1的標準溶液，連續(xù)進樣5次，測定維生素C峰面積，結果維生素C峰面積的RSD為0.05%。

圖1 高效液相色譜圖

2.6 重復性試驗 取同一供試品6份(樣品編號01)，照2.3項試驗，平均含量為標示量的100.39%，其RSD為0.62%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取20 μg·mL－1的標準溶液，在室溫條件下分別放置0、1、2、3、4、5、6、7 h后進樣測定，結果維生素C峰面積的RSD為0.53%，表明供試品溶液在7 h內穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗 精密量取2.3中已知含量的供試品溶液(1 mg·mL－1)1 mL置100 mL棕色量瓶(樣品編號01，規(guī)格100 mg·片－1，含量為73.04%，平均片重0.138 3 g，稱取0.074 40 g)，共9份，各加入DMPS溶液100 μL，按低、中、高濃度依次加入約1 mg·mL－1的維生素C標準貯備液0.6、1.0、1.4 mL，每個濃度分別配制3份，以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0± 0.1)為溶劑混合均勻。按“2.1”項下的色譜條件進行測定，通過測得量與加入量的比值來計算加樣回收率。結果其平均回收率為99.70%。

表1 回收率試驗

2.9 樣品含量測定 依正文2.3及藥典方法測定三批樣品，結果見表2。

表2 樣品測定結果(n=4)(單位:%)

3 討論

溶劑的選擇。維生素C分子中的烯二醇基具有極強的還原性，其水溶液在空氣中極不穩(wěn)定，易被氧化為二酮基而成為去氫抗壞血酸。維生素C水溶液在弱酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較好，經選擇比較，以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)為溶劑，加入水溶性抗氧劑二巰基丙烷磺酸鈉(DMPS)，其水溶液穩(wěn)定性提高。如以磷酸鹽緩沖液(pH 3.0±0.1)為溶劑，同樣加入上述抗氧劑，維生素C水溶液穩(wěn)定性稍差，且色譜圖中出現(xiàn)一個倒吸收的溶劑峰有時會干擾維生素C主峰的自動積分，故不宜選擇。以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)為溶劑，較以流動相為溶劑穩(wěn)定性又更強。以2.1色譜條件測定，加入抗氧劑的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)無任何吸收峰，所選擇的溶劑對維生素C含量測定無干擾。實驗中所配制的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)組分中分別含0.01 moL·L－1磷酸氫二鉀與0.06 moL·L－1磷酸二氫鉀，鹽含量相對較低，對色譜系統(tǒng)影響小。

測定波長的選擇。以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)為空白，取加入抗氧劑DMPS溶液的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0± 0.1)在200～400 nm范圍內進行掃描，無吸收峰;取維生素C對照品適量，按比例加入適量的DMPS溶液，以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)配成濃度為10 μg·L－1的維生素C溶液，在200～400 nm范圍內進行掃描，維生素C在266 nm處有唯一的最大吸收，確定266 nm為本實驗的測定波長。

由于維生素C易氧化，配制磷酸鹽緩沖液時所用的蒸餾水要煮沸放冷后才能使用;維生素C見光不穩(wěn)定，須避光操作，用棕色容量瓶和樣品瓶，以提高該方法的準確性。與傳統(tǒng)的滴定相比，該法靈敏度高、專屬性強，可用于維生素C片含量的測定。

［1］ 杭太俊.藥物分析［M］.第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:536.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.