水溶性脂質體運載siRNA沉默大鼠脊髓NR1表達可行性的實驗研究

胡春奎，陸建華，陳 昊，熊家祥

(1南方醫科大學，廣州510515;2廣州軍區廣州總醫院;3第三軍醫大學)

N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)的過度激活是慢性疼痛發生的關鍵原因之一［1～3］，利用小干擾RNA(siRNA)抑制NMDAR的表達來治療慢性疼痛是疼痛治療的研究熱點［4，5］。要將siRNA成功導入體內，合適有效的轉導工具是關鍵，對于神經系統而言，尋找合適的載體更具有挑戰性。低分子量聚乙烯亞胺(PEI)和膽固醇組成的水溶性脂質體(WSLP)［6～8］的出現為尋求疼痛基因治療的合適載體帶來了機遇。本研究在前期研究結果WSLP可以運載NR1/siRNA沉默PC12細胞NR1基因的基礎上［9］，繼續探討了鞘內注射WSLP/siRNA復合物沉默正常SD大鼠脊髓NR1的可行性，為下一步能否進行WSLP/siRNA復合物治療大鼠慢性疼痛的實驗研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠通過廣州軍區總醫院動物中心購買［動物使用許可證號:SYXK(軍)2007-033，SYXK(粵)2009-0100;動物質量合格證明編號: 0067400，0076491］。低分子量聚乙烯亞胺(上海晶純試劑有限公司);膽固醇氯甲酸酯(Sigma);RTPCR試劑盒(TaKaRa);BCA蛋白濃度測定試劑盒增強型(碧云天);Trizol RNA提取液(Invitrogen); NMDAR1-Antibody(兔源，CST);辣根過氧化物酶標記兔抗羊抗體(Santa進口分裝)。

1.2 WSLP的合成及其與siRNA的連接 嚴格根據早先Lee等［7］的方法再加以改進合成WSLP［6］。30 mL無水氯仿中加入100 μL無水三乙胺(TEA)混合后加入3 g PEI，冰上攪拌30 min。1 g膽固醇氯甲酸酯溶入10 mL 0℃氯仿后緩慢倒入先前溶解的PEI中。攪拌過夜，得到黃色黏稠的膠狀物。用50 mL 0.1 mol/L HCl將膠狀物溶解后，倒入200 mL無水氯仿以去除多余的聚合物和膽固醇，濾紙濾過。重復上述步驟2次，低壓凍干得到黃色粉末。siRNA的序列參照文獻［4，5］由廣州銳博公司設計合成雙鏈NR1/siRNA，正義鏈:5'-ACCAGGCCAAUAAGCGACATTdTdT-3'，反義鏈:5'-UGUCGCUUAUUGGCCUGGUTTdTdT-3'。參照文獻［7］及前期實驗結果［9］，WSLP溶于DEPC處理過的5%的葡萄糖溶液中，按照質量比為1∶5的比例將WSLP與siRNA混合。

1.3 動物實驗及分組 健康雄性SD大鼠由廣州軍區廣州總醫院動物實驗中心提供，周齡6周，體質量180～200 g，每籠6只飼養，自然照明，自由攝食、飲水。按照參考文獻［10］制作鞘內置管模型，選取置管成功的大鼠18只隨機均分為3組:NS組鞘內注射生理鹽水，WSLP/siRNA組鞘內注射WSLP和 siRNA混合物，裸siRNA組鞘內注射裸siRNA，鞘內注射均為10 μL，其中siRNA的量為1 nmol。

1.4 實驗取材 鞘內注射后第3天動物腹腔注射10%水合氯醛，冰面上摘取L4～6節段脊髓背角，均分為兩份，分別用于NR1 mRNA和蛋白表達的檢測。

1.5 Real time PCR技術測定鞘內注射WSLP/siRNA對脊髓NR1 mRNA的沉默效應 Trizol一步法提取脊髓組織中總RNA。紫外分光光度計測定總RNA的濃度及純度。以0.5 μg總RNA為模板按逆轉錄試劑盒合成第1鏈cDNA，然后以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測。引物設計如下:NR1上游引物:5'-AATGACCCCAGGCTCAGAAAC-3'，下游引物:5'-TGAAGCCTCAAACTCCAGCAC-3'，擴增片段222 bp;內參照為β-actin，上游引物:5'-TCTGTGTGGATTGGTGGCTCTA-3'，下游引物:5'-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3'，擴增片段為69 bp。反應條件: 95℃30 s，95℃ 5 s，60℃ 32 s，進行40個循環。目的基因相對定量=2－ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt實驗組－ΔCt對照組 =(Ct目標基因/實驗組－Ct內參基因/實驗組)－(Ct目標基因/對照組－Ct內參基因/對照組)。

1.6 Western blot技術測定鞘內注射WSLP/siRNA對脊髓NR1蛋白的沉默效應 將脊髓組織在4℃預冷的組織裂解液中研磨破碎，冰浴中靜置30 min，4℃，12 000 rpm離心30 min取上清，用BCA法測定測定蛋白濃度。60 μg等量總蛋白經變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳。然后轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h;將PVDF膜置入NMDAR1-Antibody兔源多克隆抗體的TBST液(1∶500稀釋)，4℃冰箱孵育過夜，加TBST液稀釋的HRP標記的二抗(1∶1 000稀釋)，37℃孵育1 h;加入ECL化學超敏發光液，X線膠片曝光成像。將膠片進行掃描，Image J軟件進行分析，計算光密度值，以β-actin為內參，計算NR1蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法 使用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，計量資料比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD兩兩比較。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WSLP/siRNA對脊髓NR1 mRNA的沉默效應NS組(4.75±0.21)和裸siRNA組(4.68±0.11)鞘內注射后第3天脊髓NR1 mRNA表達水平差異無統計學意義(P＞0.05);WSLP/siRNA組(1.00± 0.13)脊髓NR1 mRNA的表達水平比NS組和裸siRNA組低(P均＜0.05)。

2.2 WSLP/siRNA對脊髓NR1蛋白的沉默效應NS組和裸RNA組鞘內注射后第3天脊髓NR1 mRNA表達水平差異無統計學意義(P＞0.05);WSLP組脊髓NR1蛋白的表達水平比NS組和裸siRNA組低(P均＜0.01)。見圖1。

圖1 各組脊髓NR1蛋白印跡條帶

3 討論

NMDAR是興奮性神經遞質谷氨酸的離子型受體，在痛敏的產生和維持方面起關鍵作用。NR分功能亞基NR1和調節亞基NR2，利用siRNA抑制NR1的表達來治療慢性疼痛是疼痛治療的研究熱點。

要將siRNA成功導入體內，合適有效的轉導工具是關鍵。Aigner［11］認為，將合適的載體與siRNA寡核苷酸鏈直接連接是一種簡單可行的策略。新近出現的WSLP具有毒性低、轉染效率高的特點［12］。WSLP可以通過胞吞作用進入細胞，生物相容性好，WSLP的粒徑為幾十納米，可以通過血腦屏障進入中樞，另外，WSLP/siRNA直接注射到蛛網膜下腔，可以避免血液網狀內皮系統等免疫系統的識別和清除。Kim等［5］認為，WSLP可透過血腦屏障，具有中樞靶向性，是有效的神經細胞的基因運載體。本研究通過實時定量PCR與Western blot技術的結果表明，WSLP可以通過鞘內注射的途徑運載NR1/siRNA抑制SD大鼠脊髓NR1 mRNA和蛋白的表達。總之，這兩種方法相互印證，說明在體條件下WSLP可以成功運載NR1/siRNA沉默大鼠脊髓NR1。因此，有可能對大鼠的慢性疼痛具有治療作用。

綜上所述，WSLP可以運載NR1/siRNA抑制正常大鼠脊髓NR1的表達，從而推測其可以抑制慢性疼痛大鼠脊髓NR1的表達對慢性疼痛具有治療作用，這將為慢性疼痛的基因治療提供新的思路和手段。

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