透明質酸結合蛋白和CD44s與乳腺浸潤性微小乳頭狀癌高淋巴結轉移的關系

李玉桑，冷昌龍，劉躍輝

(1中南民族大學藥學院病理學研究室，武漢430074;2廣東省佛山市高明區人民醫院，佛山528500)

浸潤性微小乳頭狀癌(IMPC)屬于乳腺導管癌 形態學范疇的新類型，是一種罕見而具有高度淋巴轉移的病理組織結構.有研究表明，IMPC大多數與其他類型導管癌混雜，單純性IMPC病例少見，但占有部分比例IMPC病例同樣具有侵襲性、轉移率均高的生物學行為［1-4］.在諸多影響癌浸潤及轉移的相關因素研究中，均發現普遍存在于細胞外基質中的透明質酸(HA)與癌細胞表面受體有著一定的相互關系.Takeda等研究發現，肺腺癌組織中存在大量透明質酸［5］，并且透明質酸還能誘導腫瘤細胞黏附和遷移［5，6］.透明質酸結合蛋白(HABP)是細胞外基質中的一種蛋白多糖，可與 HA特異性結合.CD44s是一種細胞表面跨膜糖蛋白，存在于多種細胞上，并屬于粘附分子中的透明質酸受體，在許多腫瘤中均有異常表達［7］.有報道指出CD44s蛋白參與細胞-細胞，細胞-細胞外基質之間的特殊粘附，與腫瘤的浸潤和轉移相關［7-9］.Turley等發現 CD44s與HA結合后可以促使多種細胞伸出偽足，細胞運動能力增強［10］.因此，本實驗采用免疫組織SP法和組織染色法，我們將探討透明質酸結合蛋白(HABP)與CD44s在IMPC組織中的表達特征及相互關系，研究其與IMPC淋巴結轉移的相關性.

1 材料與儀器

1.1 材料

依據如圖1所示組織結構特征，鏡檢了日本廣島大學附屬醫院1990～2008年間乳腺癌手術切除病理切片標本(金子真弓副教授真誠提供)，并獲取疑似浸潤性微小乳頭狀癌的34例，然后將其石蠟標本制成4μm厚切片進行免疫組化染色.患者全為女性，年齡最大75歲，最小38歲，平均53.5歲.

1.2 實驗儀器

切片機(德國，Leiea Rm2265);超精細電動顯微鏡系統(日本，NikonEclipse Ti).

2 實驗方法

2.1 免疫組化方法

采用Super Vision兩步法，切片常規脫蠟至水后用3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶10 min，水洗后再置于枸椽酸緩沖液中微波抗原修復10 min，室溫自然冷卻.余步驟按試劑盒說明書進行，DAB顯色，蘇木素復染，樹膠封片.所用一抗CD44鼠抗人單克隆抗體，CD44抗體稀釋度為1∶100，購自NOVO CASTRA公司.免疫組化試劑盒均購自NICHIREI HISTOFINE公司.實驗設陽性對照和陰性對照(PBS代替一抗).

2.2 組織染色法

切片常規脫蠟至水后用avidin和biotin封閉液在室溫下分別孵育20min，再置于0.3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶30min，1%BSA溶液孵育1 h，加biotin標識透明質酸結合蛋白(HABP，試劑盒購自日本生化工業株式會社)2 h，HRP標識strept-abitin 15 min，以上各步驟均在室溫下進行和各步驟間用PBS緩沖液各洗3次后，進行DAB顯色.

2.3 陽性指標判定

陽性反應腫瘤細胞膜出現棕黃色顆粒，陽性細胞數大于10%判定為陽性.

2.4 統計學分析

兩組數據間的比較采用INSTAT3軟件中Fisher's exact test進行統計學處理，P＜0.05表示有顯著差異.

3 結果

3.1 疑似浸潤性微小乳頭狀癌的組織形態學鑒別診斷

疑似IMPC病例的HE切片鏡檢(如圖1)，發現該組織中具有明顯腔隙、叢狀生長的腺上皮癌細胞形成桑椹樣的微乳頭狀及不規則巢團狀、小腺管樣結構，腔隙間具有類似脈管束構造而缺乏內皮細胞.癌巢間質成分甚少，癌巢周圍的間質組織中可見明顯的淋巴管內癌細胞侵襲.據此組織形態特征將34例疑似IMPC進一步分為21例IMPC及13例Pseudo-IMPC(鑒別法參照文獻［1］).

圖1 IMPC組織學特征:在明確腔隙內、叢狀生長的腺上皮癌細胞形成桑椹樣排列的微乳頭狀癌，主瘤間質成分甚少.在主瘤周圍間質組織中可見明顯的淋巴管內癌細胞侵襲(紅色箭頭所示，彩圖見封三，HEX200)Fig.1 Distinctive histological features of IMPC

3.2 IMPC及IDC組織中HABP的表達

在對21例IMPC組織中透明質酸結合蛋白(HABP)的表達變化進行檢測時，發現其在15例癌細胞巢的外周膜及間質均表達強陽性(如圖2)，在其它5例癌細胞未表達.其在13例Pseudo-IMPC中3例呈癌細胞以及間質細胞均表達陽性，其中10例癌細胞未表達，而間質細胞表達弱陽性.兩組之間的表達差異具有顯著性的統計學意義(P=0.0042).此外，IMPC與Pseudo-IMPC之間淋巴結轉移陽性率相比較具有顯著性統計學意義(P=0.0078，表1所示).

圖2 IMPC及Pseudo-IMPC組織中透明質酸結合蛋白的表達.(A)HABP在IMPC組織中癌細胞塊的細胞膜周圍以及間質中呈現陽性;(B)HABP在Pseudo-IMPC組織中癌細胞內表達呈現陰性，而在間質細胞呈現陽性.DAB顯色，X200，彩圖見封三Fig.2 Expression features of HABP in IMPC and Pseudo-IMPC

3.3 IMPC及Pseudo-IMPC組織中CD44s的表達

對21例IMPC組織中CD44s的表達進行檢測時，發現15例IMPC癌細胞巢癌細胞連接面表達強陽性，而在癌細胞與間質相接的外側面不表達(如圖3)，其中6例癌細胞未表達.而CD44s在13例Pseudo-IMPC中8例癌細胞膜全周性呈現陽性表達，其中5例癌細胞未表達，兩組之間的表達差異沒有顯著性的統計學意義(表1所示).

圖3 IMPC及Pseudo-IMPC組織中CD44s的表達.(A)CD44s在IMPC組織中癌細胞間內側膜呈現陽性表達(不完全性表達);(B)在Pseudo-IMPC組織中癌細胞膜全周性呈現陽性表達.DAB顯色，X200，彩圖見封三Fig.3 Expression features of CD44s in IMPC and Pseudo-IMPC

表1 IMPC與Pseudo-IMPC病例組織間CD44s、HABP的表達及淋巴結轉移關系Tab.1 Expressions of CD44s and HABP related to high rate of lymph-nodemetastasis in IMPC and Pseudo-IMPC

采用Fisher's exact test檢測IMPC與Pseudo-IMPC兩組中相應數據間的差異.

4 討論

IMPC是一種罕見乳腺導管癌而具有高度淋巴轉移的生物學行為.有關IMPC的高侵襲性、高轉移率的病理機制尚不十分清楚.但在諸多影響癌浸潤及轉移的相關因素研究中，均發現細胞外基質中的透明質酸與癌細胞表面受體關系密切.透明質酸是細胞外基質的重要成份，它可與透明質酸結合蛋白(HABP)有特異結合的特性，對于維持組織結構、細胞黏附、活化、遷移以及細胞信號的轉導有重要作用，與癌細胞表面受體有著一定的相互關系［11］.由此可見，HABP與乳腺癌有一定聯系，可能參與了其侵襲和轉移過程.本研究證實了HABP在IMPC組織中癌細胞及間質細胞中均呈強陽性表達.結合臨床IMPC病例淋巴結轉移率高的統計結果，可見，HABP與IMPC有著一定的聯系，可能參與了其侵襲和轉移的過程.

CD44s作為一種細胞表面跨膜糖蛋白，主要參與細胞間、細胞與基質間的特異性黏附過程.其在腫瘤組織中過表達，為腫瘤細胞的增殖、分化、轉移和侵襲提供微環境［12］.CD44s也可通過促進腫瘤細胞與血管內皮細胞和細胞外基質的黏附，促進腫瘤細胞向基質侵襲，從而影響腫瘤細胞的遷移和運動能力［13，14］.本研究發現 CD44s在 IMPC 組織中癌細胞巢團內癌細胞連接面表達強陽性，而在癌細胞與間質相接的外側面表達缺失，提示IMPC癌細胞團內細胞間結合力強，而癌細胞團與間質細胞缺乏結合粘附力.癌細胞巢團內細胞之間結合緊密表明其具有更強的運動能力和侵襲能力.而在IMPC的癌巢周圍間質富含大量淋巴管生成［15，16］，豐富的淋巴管不僅為腫瘤細胞提供了轉移通路，還能分泌多種營養或趨化腫瘤細胞的因子，促進腫瘤細胞存活與轉移.Bourguignon等發現透明質酸與CD44s結合不僅影響細胞間粘附，而且刺激各種腫瘤細胞特異性功能促進乳腺癌的發展［17］.透明質酸也可使CD44s在癌細胞表面脫落.結合CD44s在IMPC中的表達特征以及IMPC的高淋巴結轉移率，CD44s的脫落極有可能促進IMPC癌細胞巢團與間質的脫離，使癌細胞遠離原發灶，進入淋巴道而造成侵襲、轉移.

綜上所述，CD44s在IMPC細胞中的不完全性表達和透明質酸結合蛋白的高表達，為 IMPC的淋巴道侵襲、轉移潛能力提供了有利的微環境，是乳腺IMPC高淋巴轉移的潛在高危因子.

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