利用光學成像系統非侵入性監測乳腺癌細胞在骨環境內的生長情況

嚴偉，金芳純，范啟明，湯亭亭

利用光學成像系統非侵入性監測乳腺癌細胞在骨環境內的生長情況

嚴偉，金芳純，范啟明，湯亭亭

目的應用穩定表達紅色熒光蛋白的人乳腺癌 MDA-MB-231SArfp 細胞系，建立乳腺癌骨移植瘤動物模型，并應用活體成像技術檢測腫瘤的生長情況。

方法注射 MDA-MB-231SArfp 細胞于 BALB/c 雌性裸小鼠脛骨髓腔，應用活體光學成像系統，連續觀察腫瘤細胞在體內的生長情況，同時測量腫瘤體積的變化；4 周和 7 周時拍攝 X 線片并做組織學檢查，評估腫瘤對骨組織的影響。

結果利用活體光學成像系統監測發現，至第 3 ～ 4 周期間，腫瘤進入對數生長期；腫瘤大小與熒光信號強度呈線性正相關。X 線片和組織切片顯示 MDA-MB-231SArfp 細胞形成溶骨性的骨破壞。

結論成功建立了可非侵入性監測的乳腺癌骨移植瘤模型，利用活體光學成像系統結合 X線片及組織學檢查能夠直觀、連續、準確地檢測腫瘤細胞在骨環境內的生長情況，為后續抗腫瘤藥物的篩選和評價提供了新的手段和工具。

乳腺腫瘤； 疾病模型，動物； 診斷顯像；熒光 X 線攝影術

與生物發光技術相比，熒光成像技術具有標記靶點的多樣性、一次可以應用不同的熒光基因標記不同的細胞的優勢，因而在分子生物學研究和觀察小分子體內代謝（如腫瘤細胞、免疫相關細胞）等方面已經廣泛應用。目前常用的熒光基團以表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）為代表，無需底物即可自發熒光，對細胞幾乎無毒性。

本實驗利用穩定表達紅色熒光蛋白（RFP）的人乳腺癌 MDA-MB-231SArfp 細胞系，通過裸鼠脛骨髓腔注射，建立乳腺癌骨移植瘤動物模型，利用活體熒光成像技術對此模型內的腫瘤生長進行非侵入性的連續監測，同時進行 X 線片、組織切片的檢查，發現乳腺癌細胞在骨環境內的生長規律，為后續在動物體內進行抗乳腺癌骨轉移藥物研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及培養 RFP 標記的乳腺癌細胞系MDA-MB-231SArfp 獲贈于澳大利亞西澳大學Jiake Xu 教授，此細胞系是從乳腺癌骨轉移灶中分離的細胞，具有骨轉移的特性[15]。常規培養于含10% 胎牛血清和 G-418（0.75 mg/ml，用于篩選穩定表達 RFP 的細胞[16]）的 DMEM 培養液（美國HyClone 公司產品）中，置于 CO2體積分數為 5%、37 ℃ 飽和濕度的培養箱中培養傳代。

1.1.2 實驗動物及分組 4 ～ 5 周齡 BALB/c 雌性裸鼠 20 只，體重約 20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，均飼養于無特定病原體的環境下。10 只用于活體熒光成像檢測，并記錄生存曲線；另外 5 只于注射腫瘤細胞 4 周后處死，拍攝X 線片并做組織學檢測，剩余 5 只于注射腫瘤細胞 7 周后處死，拍攝 X 線片并做組織學檢測。

1.1.3 儀器 小動物活體成像儀為美國 Xenogen公司的 IVIS spectrum。

1.2 方法

1.2.1 熒光顯微鏡下觀察 MDA-MB-231SArfp細胞的 RFP 表達 取對數生長期的 MDA-MB-231SArfp 細胞，置于熒光顯微鏡下，觀察其紅色熒光蛋白表達的情況。

1.2.2 活體成像系統檢測 MDA-MB-231SArfp 細胞的熒光表達 用 PBS 緩沖液將 MDA-MB-231SArfp 細胞在黑色的 96 孔板中進行倍比稀釋，每孔 100 μl，細胞數從 10 000/孔到 78/孔，最后一孔用 PBS 作為陰性對照。用活體成像系統檢測不同細胞數量的熒光強度，采集并分析數據，繪制細胞數量與熒光強度的量-效關系曲線。

1.2.3 乳腺癌骨移植瘤模型的構建和熒光檢測 取對數生長期的 MDA-MB-231SArfp 細胞株以 0.2% 的胰酶消化，用 DMEM 培養液終止消化后，制成細胞懸液，1000 r/min 離心 4 min 后重懸于 PBS 中。用臺盼藍染色測定細胞存活率，發現細胞存活率大于 98%。用 PBS 調整細胞密度為1 × 107/ml；按每只裸鼠 0.1 ml 懸液的劑量注射于20 只 BALB/c 雌性裸小鼠的脛骨髓腔內，隨機選取 10 只在 2 h 內檢測熒光強度并記錄，以后每周進行一次活體熒光檢測并記錄，同時記錄每只裸鼠的死亡時間，繪制生存曲線。

1.2.4 腫瘤體積測量 每周用游標卡尺測量腫瘤長徑、短徑和厚度，計算移植瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。移植瘤體積按公式：V = 4/3 π（a × b × c）（V 為腫瘤體積；a 為長徑/2；b 為短徑/2；c 為厚度/2）進行計算。

1.2.5 X 射線片和組織學檢查 注射腫瘤細胞4 周后和 7 周后分別對荷瘤裸鼠進行 X 射線檢查。移植瘤取下后用 4% 多聚甲醛固定 24 h，流水沖洗過夜，以 10% EDTA 于 4 ℃ 脫鈣 3 周后石蠟包埋，做組織切片，HE 染色并觀察。

1.3 統計學處理

所有數據使用 SPSS13.0 軟件進行處理，計量資料以x±s表示，相關性采用 SPEARMAN 等級相關進行分析，雙側檢驗水準為 α = 0.05，所有檢驗以P＜ 0.05 認為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 MDA-MB-231SArfp 細胞的 RFP 表達

RFP 標記的 MDA-MB-231SA 細胞為多邊形上皮樣細胞，貼壁生長，熒光顯微鏡觀察可見細胞表達的熒光信號較強，熒光較為均勻地分布于整個細胞內，表達率接近 100%，細胞在體外能夠穩定表達紅色熒光蛋白，并且隨體外長期傳代培養無明顯消褪（圖 1）。

2.2 活體熒光成像檢測 MDA-MB-231SArfp 細胞的 RFP 體外表達

通過活體熒光成像系統 IVIS 觀察不同濃度的 MDA-MB-231SArfp 細胞熒光表達，結果發現，該成像系統能夠檢測的最小細胞數為 500 ～ 700個腫瘤細胞，儀器靈敏度較高，隨著細胞濃度的遞增，熒光表達的強度也逐漸增加，即平均熒光量子數與細胞濃度成正比（r2= 0.9449，P＜ 0.05)（圖 2）。

圖 1 熒光顯微鏡觀察發現 MDA-MB-231SArfp 細胞穩定表達 RFP[A、C 為普通光鏡下照片；B、D 為熒光顯微鏡照片（A、B × 40；C、D × 100）]Figure 1 Fluorescence micrograph incicated that red fluorescence proteins stably expressed in MDA-MB-231SArfp cells.A, C:Bright field; B, D: Fluorescent field (A、B × 40; C、D × 100)

圖 2 活體光學成像系統體外檢測 MDA-MB-231SArfp 細胞 RFP 表達[A：MDA-MB-231SArfp 細胞倍比稀釋檢測熒光信號強度；B：細胞熒光強度與細胞數目線性相關（r2 = 0.9449，P ＜ 0.005）]Figure 2 The RFP expression of MDA-MB-231SArfp cells detected by the optical imaging system in vitro [A: In vitro fluorescent intensity of various cell numbers of MDA-MB-231SArfp cells; B: The correlation analysis between cell numbers and fluorescent intensity (r2 = 0.9449, P ＜ 0.005)]

圖 3 活體光學成像系統非侵入性監測乳腺癌細胞在骨內的生長情況Figure 3 Non-invasive monitoring of the growth of MDA-MB-231SArfp breast cancer cells in bone using the optical imaging system

2.3 活體熒光成像動態觀察 MDA-MB-231SArfp細胞在體內生長情況

注射 MDA-MB-231SArfp 細胞 2 h 內檢測，能觀察到注射部位的熒光信號。1 周和 2 周后活體熒光成像檢測，熒光信號主要集中于肺內，而脛骨部位信號相對較弱，考慮為注射于脛骨髓腔的腫瘤細胞有部分進入血液循環，在肺內有短暫的停留（1 ～ 2 周），肺內環境并非 MDA-MB-231SArfp細胞最適宜生長的“土壤”，最終循環內的腫瘤細胞要么死亡，要么繼續循環定植于骨微環境中。在第 3 ～ 4 周期間，腫瘤進入對數生長期，熒光信號較強且穩定集中于腿部，至第 7 周達到高峰，背部和肺內可見散在的熒光信號表達，考慮為轉移灶（圖 3和圖 4A）。

圖 4 乳腺癌細胞在體內的生長情況和荷瘤裸鼠生存情況[A：乳腺癌細胞熒光強度變化隨時間變化曲線；B：腫瘤體積隨時間生長曲線；C：移植瘤體積和熒光強度的相關性分析（r2 = 0.8563，P ＜ 0.005）；D：裸鼠的生存曲線（n = 10）]Figure 4 The growth of breast cancel cells in vivo and survival time of the nude mice bearing the tumor [A: The fluorescent intensity of MDA-MB-231SArfp cells detected by the optical imaging system changed with time; B: The tumor volume changed with time; C: The correlation analysis between tumor volume and fluorescent intensity (r2 = 0.8563, P ＜ 0.005); D: The survival time of the nude mice bearing the tumor (n = 10)]

2.4 腫瘤體積變化情況

3 周時肉眼可見腫瘤，3 ～ 4 周間腫瘤明顯生長（圖 4B），至第 6 周，6 只動物腿部都出現了不同程度的壞死，第 7 周時游標卡尺測量腫瘤體積可達（9.39 ± 1.15）cm3，相關性分析顯示，移植瘤體積與表示活體腫瘤細胞生長情況的熒光量子數成正相關（r2= 0.8563，P＜ 0.05）（圖 4C）。第6 周開始，由于腫瘤體積過大以及轉移的發生，荷瘤小鼠開始死亡，生存曲線見圖 4D。

2.5 X 線片和組織切片觀察結果

4 周的 X 線片即可以觀察到 MDA-MB-231SArfp 細胞在脛骨造成了溶骨性的骨缺損（圖5），和文獻[16-17]報道的時間相一致，7 周時脛骨幾乎完全破壞吸收。4 周和 7 周的 HE 染色切片在顯微鏡下都可觀察到腫瘤細胞侵襲骨質，造成了骨質破壞（圖 5）。

3 討論

本實驗用紅色熒光蛋白標記的乳腺癌細胞構建了骨移植瘤裸鼠模型，Yang 等[18]認為紅色熒光蛋白有較高的敏感性和分辨率，DsRed 的激發和發射波長較長，其發射峰位于培養基、組織培養器材及細胞成分等產生的熒光背景范圍之外，而且DsRed 對 pH 值不敏感，pH 值為 4.5 ～ 12 時仍保持穩定。

圖 5 乳腺癌在骨內生長的 X 線片和組織切片觀察結果（A ～ C 為未注射腫瘤細胞的正常裸鼠；D ～ F 為注射腫瘤細胞4 周后的觀察結果；G ～ I 為注射腫瘤細胞 7 周后的觀察結果；B、E、H 為 X 線片，其中白色箭頭顯示骨缺損位置；C、F、I 為 HE 切片，黑色箭頭指示骨組織，紅色箭頭為腫瘤組織）Figure 5 The radiographic and histological analysis of the growth of breast cancer cells in bone (A - C: Acquired from normal mice without MDA-MB-231SArfp cells inoculation; D - F: Acquired from mice with MDA-MB-231SArfp cells inoculated after 4 weeks ;G - I: Acquired from mice with MDA-MB-231SArfp cells inoculated after 7 weeks; B, E, H are X-ray images with the white arrows indicated the osteolytic lesions; C, F, I are HE staining micrographs from of xenograft in tibia with red arrows indicated the tumor tissue and the black arrows indicated the bone tissue)

實驗應用的乳腺癌 MDA-MB-231SArfp 細胞株紅色熒光表達率接近 100%，信號較強，體外用G418 篩選經過多次傳代未見有熒光衰減趨勢。本實驗建立的乳腺癌骨移植瘤裸鼠模型及其熒光影像分析研究，具有以下優點：①敏感性：RFP 激發波長長，敏感性高，抗干擾能力優，穿透力強，利用它建立的可視化腫瘤模型效果，與其他幾種成像模式（X 射線、CT、超聲、磁共振、核醫學）相比有更高的敏感性[8]，本實驗中活體熒光成像自注射細胞起就能持續看到熒光的表達，而肉眼要到第3 周才能觀察到腫瘤；②直觀性：實驗中只需將動物置于活體熒光成像系統下觀察，即可見腫瘤生長的部位、大?。虎圻B續性：傳統的動物實驗方法需要在不同的時間點犧牲實驗動物以獲得數據，得到多個時間點的實驗結果。相比之下，利用活體熒光成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，直接觀察腫瘤的生長及跟蹤腫瘤的轉移，使實驗有很好的連續性，所得的數據更加真實可信，而且大大減少了實驗所需的動物數量；④準確性：本實驗中，IVIS 系統可以對熒光信號的強度進行量化處理，從而可以進行定量分析比較，提高結果的準確性。

本實驗中還將活體熒光成像的數據和腫瘤體積測量、X 線片、組織學檢查結果進行了分析比較，發現腫瘤生長體積、骨質破壞程度與乳腺癌細胞在體內的生長情況有較好的相關性。由于 X 線片能夠直觀地反映腫瘤細胞對骨質的破壞，組織切片能在細胞水平看到腫瘤細胞與骨組織的相互作用，三者的相互結合能夠從不同的層面反映腫瘤發生和發展的過程，得到全面的、準確的數據，這對腫瘤的早期診斷和早期治療研究及抗癌藥物的療效評估有重要的意義。

盡管活體成像技術具有靈敏度高、操作簡單、結果直觀等優點，但是也存在一些問題，比如在成像過程中，有些細胞（如血紅蛋白等）會發出其自身的熒光，干擾觀察結果。本實驗中，第 4、5 周觀察時，腫瘤體積相對較大，但表達熒光的腫瘤細胞仍在組織深處，所以檢測到的熒光強度相對偏弱，在第 6、7 周時，腫瘤細胞生長至皮膚表淺處，熒光信號相對較強，與腫瘤體積相一致。有研究指出，利用熒光素酶標記的生物發光技術，在活體成像系統下有較強的穿透力，并能排除干擾信號，或許能彌補熒光蛋白發光的此項不足[19]。

綜上所述，本實驗成功建立了可非侵入性監測的乳腺癌裸鼠骨移植瘤模型，可利用活體熒光成像技術對乳腺癌細胞在骨環境內的生長情況進行直觀、連續和定量的觀察及分析，為抗腫瘤藥物的篩選和評價提供了新的手段和工具。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):164-170

Non-invasive monitoring of the growth of breast cancer cells in bone environment using the optical imaging system

YAN Wei, JIN Fang-chun, FAN Qi-ming, TANG Ting-ting

ObjectiveTo establish the xenograft tumor model with human breast cancer cells MDA-MB-231SArfp stably expressing red fluorescent protein (RFP) and monitor the growth of breast cancer cells in bone environment using thein vivoimaging system.

MethodsMDA-MB-231SArfp cells were injected intra-tibially into BALB/c-nu female nude mice.The tumor cells growthin vivowas monitored by thein vivoimaging system and tumor volume were measured every week.Seven weeks after intra-tibial inoculation, the mice were sacrificed and hind limbs were taken out for the radiographic and histological analysis.

ResultsThe results examined by thein vivoimaging system showed that the MDA-MB-231SArfp cells started rapid growth at the 3 weeks after inoculation and the changes of fluorescent intensity correlated well with the increased tumor volume.X-ray images and HE stained tissues demonstrated that MDA-MB-231SArfp cells induced more severe osteolytic lesions at the 7 weeks than 4 weeks after inoculation.

ConclusionsWe successfuly established the non-invasive monitoring xenograft animal model using breast cancer cells labeled by the red fluorescent protein.Thein vivoimaging system, combined with radiographic and histological analysis, could provide a visualized, continuous, and reliable platform to monitor the growth of breast cancer cells in bone environment, which can used to screen and evaluate the new anti-tumor drugs.

Breast neoplasms; Disease models, animal; Diagnostic imaging; Photofluorography

TANG Ting-ting, Email: tingtingtang@hotmail.com

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2012, 7(3):164-170

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.002

活體光學成像技術，包括生物發光與熒光成像技術，目前已成為醫學、生物學及藥物開發等研究領域發展最迅速的前沿技術。生物發光技術是以熒光素酶基因作為目的基因，將其轉染至靶細胞或靶器官，觀察時加入外源性熒光素底物，在轉染細胞表達的熒光素酶的作用下，轉變為可見光能釋放，再利用活體光學成像系統檢測[1-3]；熒光技術是采用熒光蛋白基團標記細胞，使細胞穩定表達熒光蛋白，之后利用激發光使熒光蛋白達到較高的能量水平，然后發射出較長波長的光，最后通過活體熒光成像系統檢測[4-10]。應用傳統的檢測方法（比如 X射線、放射性核素成像等）進行動物實驗時，需要在不同的時間點處死實驗動物以獲得數據，缺乏連續性及整體性。相比之下，活體光學成像技術能直接監測活細胞在動物體內的生物學行為及跟蹤分

國家自然科學基金（81172549）；上海市優秀學術帶頭人計劃（11XD1403300）；上海教委重點學科建設基金（J50206）

200011 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院骨科，上海市骨科內植物重點實驗室

湯亭亭，Email：tingtingtang@hotmail.com

2012-02-06子信號，是檢測實驗動物體內細胞及分子機制的強有力手段，在當前歐美等發達國家已被廣泛地應用于感染、腫瘤免疫及治療、基因治療、自身免疫性疾病、藥物開發等生物醫學領域[8,11-14]。

Author Affiliation: Department of Orthopedic Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China

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