基于反義RNA技術的FabI抑制劑篩選模型的構建

殷瑜，戈梅，錢秀萍，陳代杰

基于反義RNA技術的FabI抑制劑篩選模型的構建

殷瑜，戈梅，錢秀萍，陳代杰

目的基于反義 RNA 沉默技術構建針對細菌 FabI 的超敏全細胞篩選模型，用于篩選 FabI 抑制劑。

方法以Escherichia coli基因組 DNA 為模板，PCR 擴增fabI基因的 -74 ～ 86 bp 核苷酸序列，反向插入攜帶 paired termini 結構的反義質粒 pHN678 中，得到重組質粒pHNF，再轉化至E.coli中，得到反義工程菌E.coli/pHNF；通過平板表型觀察對反義工程菌進行篩選；考察了 IPTG濃度對篩選模型的影響，確定 96 孔板抗菌篩選模型的條件，并用三氯生作為陽性對照、氨芐西林和淺藍菌素作為陰性對照對該模型進行評價。

結果獲得了針對fabI的反義工程菌，確定了最適 IPTG濃度為 40 μmol/L，成功構建了 FabI 特異性酶抑制劑的超敏全細胞篩選模型，并驗證了其可行性。應用該篩選模型對5847 個內生真菌次級代謝產物進行活性篩選，初篩陽性率約為 9.7%，經復篩后獲得 8 份陽性樣品。

結論成功建立了基于反義 RNA 沉默技術的 FabI 超敏全細胞篩選模型，并利用該模型篩選到 8 份陽性樣品。

RNA，反義； 藥物評價，臨床前； 烯脂酰-ACP 還原酶

反義 RNA 技術可以在轉錄或翻譯水平沉默靶基因，選擇性控制靶基因的蛋白表達量，從而使所構建反義菌株對外界特異性抑制劑非常敏感。該技術已經成功用于抗菌藥物篩選模型的構建，并篩選獲得了能夠有效抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素腸球菌（VRE）的平板霉素[6-7]。本文應用反義 RNA 技術構建針對 FabI的反義Escherichi coli工程菌，以此構建靶向 FabI的全細胞篩選模型，并將該模型用于篩選植物內生菌代謝產物的活性組分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及連接酶E.coliDH5α、E.coliBL21、E.coliTOP10 菌株由本實驗室保藏；質粒pHN678（攜帶 paired termini 結構）由英國皇家獸醫學院 Liam Good 實驗室贈送；PCR 產物純化和凝膠回收試劑盒購于杭州愛思進生物技術公司；T4 DNA 連接酶、PrimeStar HS DNA 聚合酶和各類內切酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 儀器 680 型酶標儀為美國 Bio-Rad 公司產品；棱光 UV762 紫外/可見分光光度計為上海精密科學儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的構建及驗證

1.2.1.1 反義工程菌的構建 根據E.coliBL21（DE3）基因組（Gene-Bank號：NC012947）設計用于擴增as-fabI片段的引物，由上海生工生物工程公司合成。PCR 產物經電泳鑒定、純化后重組至pHN678 中獲得重組質粒 pHNF，轉化進入E.coli/TOP10 感受態細胞中，再通過質粒酶切驗證。

重組質粒和空白質粒 pHN678 分別轉化E.coli，獲得相應反義工程菌株E.coli/pHNF 及對照菌E.coli/pHN678。反義引物：as-fabI正向：CCG GAGCTC（XhoI）TTCGTACTGTTTACTAAAAC；as-fabI反向：TAATCCATGG（NcoI）TGCATCGCC TGAGCGATACC。PCR 擴增條件為：94 ℃ 預變性2 min；94 ℃、2 min，共 30 次循環變性；51.5 ℃30 s；72 ℃ 30 s；72 ℃ 延伸 4 min。

1.2.1.2 反義工程菌的篩選 采用平板表型觀察法，陽性菌在含誘導劑 IPTG 的平板上生長受抑制。將單菌落挑至液體 LB 培養基中，37 ℃ 過夜培養后，對其進行適當稀釋后，以攜帶空白質粒pHN678 的菌株作為對照，取 10 μl 點種于含有一定濃度 IPTG 及 30 μg/ml 氯霉素的平板上過夜培養。以經低濃度 IPTG 誘導、生長最易受抑制的菌落為最適工程菌。

1.2.2 FabI 抑制劑液體篩選模型的建立 在兩塊無菌 96 孔板各孔中分別加入OD630值為 0.1 的初始菌濃、氯霉素濃度為 30 μg/ml、IPTG 濃度分別為 0、5、10、20、30、40、50、60 μmol/L 的 LB液體菌（反義工程菌株E.coli/pHNF 及對照菌E.coli/pHN678）懸液 150 μl，于 37 ℃、100 r/min 條件下振蕩過夜培養，用酶標儀測定OD630，分析數據，選取影響反義菌株生長的 IPTG 臨界濃度為篩選模型濃度。

1.2.3 模型評價 以 0.5、2.5、5.0 μg/ml 的氨芐西林和 15、22.5、30 μg/ml 的淺藍菌素為陰性對照，以 25、37.5、50 μg/ml 三氯生為陽性對照評價該篩選模型的有效性，每隔 1 h 測定OD630值。每個濃度重復 3 次。

1.2.4 樣品活性篩選流程 在 1.2.2 模型建立的基礎上將 100 μg/ml 的待測樣品加入不同濃度IPTG 菌懸液的 96 孔板培養孔中，37 ℃、100 r/min條件下振蕩過夜培養，用酶標儀測定OD630，以如下公式計算抑制率。

2 結果

2.1 反義工程菌的構建及篩選

2.1.1 反義質粒的構建及驗證 如圖 1所示，通過 PCR 方法擴增得到的產物大小為 179 bp，與所選擇的基因長度（包含引物中的酶切位點和保護堿基）相符。

圖 1 fabI 基因 -75 ～ 86 bp 序列的 PCR 擴增結果Figure 1 PCR product of fabI -75 ～ 86 bp

PCR 產物與 pHN678 連接獲得重組質粒pHNF，轉化E.coliDH5α 后經酶切驗證，結果如圖 2，說明fabI基因的 -75 ～ 86 bp 序列以正確的方向插入到 pHN678 中。

圖 2 重組質粒 pHNF 的雙酶切鑒定Figure 2 Enzymatic identification of pHNF

圖 3 E.coli DH5α/pHNF、E.coli TOP10/pHNF 和 E.coli BL21/pHNF 的表型觀察結果（678：E.coli/pHN678；F：E.coli/pHNF；D：E.coli DH5α；B：E.coli BL21；T：E.coli TOP10）Figure 3 Phenotype of E.coli DH5α/pHNF, E.coli TOP10/pHNF and E.coli BL21/pHNF (678 and F indicate E.coli/pHN678 and E.coli/pHNF, respectively.D: E.coli DH5α; B: E.coli BL21; T: E.coli TOP10)

表 1 IPTG 濃度對 E.coli TOP10/pHN678 和 E.coli TOP10/pHNF 生長的影響Table 1 Effect of IPTG on the growth of E.coli TOP10/pHN678 and E.coli TOP10/pHNF

圖 4 氨芐西林對 E.coli TOP10/pHN678（A）和 E.coli TOP10/pHNF（B）生長曲線的影響Figure 4 Effect of ampicilin on the growth curve of E.coli TOP10/pHN678 (A) and E.coli TOP10/pHNF (B)

2.1.2 宿主的選擇 選擇E.coliDH5α、E.coliTOP10、E.coliBL21 作為宿主，考察各反義工程菌的敏感性。結果（圖 3）表明在接種量、IPTG 濃度一定時，E.coliTOP10/pHNF 更容易受抑制。因此，選擇E.coliTOP10/pHNF 用于后續抗菌篩選模型的構建。

2.2 FabI 抑制劑液體篩選模型條件的確立

由表 1 看出，40 μmol/L 為 IPTG 的臨界濃度。當 IPTG 濃度低于該濃度時，工程菌E.coliTOP10/pHNF 與對照菌E.coliTOP10/pHN678 兩者OD值相近。高于 40 μmol/L 時，工程菌的OD值低于對照菌，且隨著 IPTG 濃度升高差距越明顯。

因此，確立篩選模型條件為：96 孔酶標板各孔加入含有 30 μg/ml 氯霉素、40 μmol/L IPTG 的LB 液體培養基 150 μl，初始菌濃OD630為 0.1。加入一定濃度的待測樣品后，37 ℃，100 r/min 振蕩培養過夜。比較同一樣品對應的對照孔（含對照菌）和測試孔（含反義工程菌）的OD630值，測試孔的OD值低于對照孔的為陽性結果孔。

2.3 FabI 抑制劑篩選模型的驗證

選用氨芐西林（常規細菌抑菌劑）和淺藍菌素（細菌 FabF/FabH 抑菌劑）作為陰性對照，三氯生作為陽性對照，驗證上述模型條件的可行性。

圖 5 淺藍菌素對 E.coli TOP10/pHN678（A）和 E.coli TOP10/pHNF（B）生長曲線的影響Figure 5 Effect of cerulenin on the growth curve of E.coli TOP10/pHN678 (A) and E.coli TOP10/pHNF (B)

圖 6 三氯生對 E.coli TOP10/pHN678（A）和 E.coli TOP10/pHNF（B）生長曲線的影響Figure 6 Effect of tricloson on the growth curve of E.coli TOP10/pHN678 (A) and E.coli TOP10/pHNF (B)

由陰性對照實驗結果可知，工程菌和對照菌隨氨芐西林和淺藍菌素濃度變化呈現相同的抑制趨勢（圖 4 和圖5），而陽性對照組的實驗結果顯示，當三氯生濃度低于 25 μg/ml 時，兩株菌株均未被抑制；而增至 37.5 μg/ml 及 50 μg/ml 時，兩株菌均出現抑制現象，且工程菌的被抑制程度明顯高于對照菌（圖 6）。說明該篩選模型的特異性及靈敏度較高，達到理想要求。

2.4 樣品的活性篩選結果

2.4.1 樣品初篩 將實驗室化合物庫保藏的5847 份植物內生真菌發酵凍干樣品應用于 FabI抗菌藥物篩選模型上進行篩選，獲得了 559 份陽性樣品，陽性率為 9.7%。

2.4.2 樣品復篩 從 559 份初篩陽性樣品的對應產生菌株中挑選了 60 株重新發酵制備樣品，應用模型篩選方法進行復篩，得到 8 份陽性樣品，陽性率為 13.3%。

3 討論

自然界中微生物的多樣性及其代謝產物的多樣性，提供了發現新藥以及先導化合物的不竭動力。但隨著從微生物次級代謝產物中獲得的抗生素的大量問世，應用常規抗生素篩選模型，從自然界篩選和發現新藥變得越來越困難[8]，而應用反義技術發現的新型抗生素—平板霉素為解決抗菌藥物篩選問題帶來了曙光[6-7]。本研究中我們應用反義RNA 技術建立了以 FabI 為靶點的超敏全細胞藥物篩選模型，初篩獲得了 559 份陽性樣品，但對其中的 60 份樣品復篩后僅獲得了 8 份陽性樣品，這可能是復篩所用樣品為再發酵樣品，再發酵過程中植物內生菌的易退化性導致了發酵樣品的活性丟失。期望能夠通過化合物分離純化的方法，獲得針對 FabI 的靶標明確、細胞滲透性強、毒性小的活性化合物。

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戈梅, 陳代杰.關注微生物來源的新藥開發.生命科學, 2005,17(1):15-18.

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):197-201

Establishment of screening model for FabI inhibitors based on antisense RNA technology

YIN Yu, GE Mei, QIAN Xiu-ping, CHEN Dai-jie

ObjectiveTo establish a highly sensitive whole-cell screening model targeting FabI based on antisense RNA silencing technology for FabI inhibitors screening.

MethodsIn order to improve silencing effect, vector with paired termini was utilized.Transformants were identified by phenotype screening on solid plates.Effect of IPTG concentration was studied and the optimal screening parameters were determined.Triclosan and ampicillin were used as positive and negative control to evaluate the feasibility of this screening model, respectively.

ResultsFabI antisense strain was obtained.The optimal concentration of IPTG was 40 μmol/L.The highly sensitive whole-cell FabI specific inhibitor screening model was established and evaluated.5847 fermentation samples from endophytic fungi were screened and the positive rate was about 9.7%.Eight active samples were gained in secondary screening.

Conclusion One highly sensitive whole-cell FabI specific inhibitor screening model was established based on antisense RNA technology and eight active samples were gained.

RNA, antisense; Drug evaluation, preclinical; FabI

CHEN Dai-jie, Email: hccb001@163.com

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2012, 7(3):197-201

隨著抗生素的濫用，臨床致病菌的耐藥性問題也日趨嚴重[1]。研究新的抗菌靶點、并基于此建立新的篩選模型成為發現抗耐藥菌新藥的重要途徑。脂肪酸是細胞生物膜等的重要組成成分，而細菌和人類的脂肪酸合成分屬于兩種途徑，前者進行的是II 型脂肪酸合成途徑，而后者則屬于 I 型，這一差別使得細菌脂肪酸合成酶系成了當今新型抗菌藥物篩選的靶位之一[2-4]。烯脂酰-ACP 還原酶（FabI）是大部分細菌脂肪酸合成所必需的酶，是一種由fabI基因編碼的 NADH 或 NADPH 依賴型單功能酶，而真核細胞中沒有此酶，它已逐漸成為抗菌藥物研究的熱點靶位。傳統的 FabI 抑制劑是二氯苯氧氯酚（三氯生），已被廣泛應用于肥皂、牙膏等日用化學品之中[5]。但到目前為止，還

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.007

“重大新藥創制”科技重大專項（2009ZX09302-004）；國家自然科學基金（81102355）

200240 上海交通大學藥學院（殷瑜、錢秀萍、陳代杰）；200240 上海來益生物藥物研發中心（殷瑜、戈梅）；200040 上海醫藥工業研究院（陳代杰）

陳代杰，Email：hccb001@163.com

2012-03-29沒有細菌脂肪酸生物合成酶 FabI 抑制劑在臨床上得到應用。因此，尋找化學結構新穎、特異性強、低毒高效的抗菌新藥 FabI 抑制劑，仍然是藥物研究工作者重要的研究領域。

Author Affiliations: School of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University, 200240 Shanghai, China (YIN Yu, QIAN Xiu-ping, CHEN Dai-jie); Shanghai Laiyi Biological Drug Research and Development Center Co.Ltd., 200240 Shanghai, China (YIN Yu, GE Mei);Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, 200040 Shanghai, China (CHEN Dai-jie)

·論著·