D-二聚體單克隆抗體制備及其在免疫熒光快速定量檢測(cè)中的應(yīng)用

康可人，吳培鈿，盧艷華，張健，唐時(shí)幸，王繼華

D-二聚體單克隆抗體制備及其在免疫熒光快速定量檢測(cè)中的應(yīng)用

康可人，吳培鈿，盧艷華，張健，唐時(shí)幸，王繼華

D-二聚體（D-dimer，D-D）是纖維蛋白單體經(jīng)活化因子 XIII 作用后形成的交聯(lián)纖維蛋白凝塊，再經(jīng)纖溶酶水解所產(chǎn)生的一種特異性降解產(chǎn)物，醫(yī)學(xué)應(yīng)用上將它作為一個(gè)特異性的纖溶過(guò)程標(biāo)記物，反映纖維蛋白溶解功能[1]。與纖維蛋白破壞有關(guān)的疾病，如深靜脈血栓形成（DVT）、肺栓塞（PE）和彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）等，均可導(dǎo)致體內(nèi) D-D水平升高[2-6]。近年來(lái) D-D 的臨床應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，除了以上提及的疾病外，在惡性腫瘤、糖尿病、肝臟疾病、膿毒血癥的診斷以及溶栓治療監(jiān)測(cè)方面均具有重要的參考價(jià)值[7-9]。

目前 D-D 蛋白檢測(cè)方法主要有膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和第二代膠乳凝集法（免疫比濁法）[10]。膠體金法快速簡(jiǎn)單，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)；ELISA 法可精確定量，但操作步驟繁瑣；免疫比濁法敏感性高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但試劑以進(jìn)口為主[11]。熒光免疫定量檢測(cè)技術(shù)，屬于即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing，POCT）[12]領(lǐng)域的新興技術(shù)，能快速、靈敏、簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)指標(biāo)的定量檢測(cè)，免疫熒光定量檢測(cè)技術(shù)經(jīng)過(guò)一定階段的發(fā)展，目前主要在感染性指標(biāo)（如C 反應(yīng)蛋白）和心臟標(biāo)志物指標(biāo)的應(yīng)用上較為多見(jiàn)，廠家以歐美、韓為主。本研究利用雜交瘤技術(shù)制備篩選能穩(wěn)定分泌特異性抗 D-D 抗體的細(xì)胞株，初步應(yīng)用于免疫熒光定量檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對(duì) D-D 快速定量檢測(cè)，為臨床相關(guān)疾病的診斷、治療、監(jiān)測(cè)提供有效工具與手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及動(dòng)物 人源 D-二聚體蛋白購(gòu)自英國(guó) Abcam公司；纖維蛋白原購(gòu)自北京博潤(rùn)萊特科技公司；人纖溶酶、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）、小鼠單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、HAT、HT、聚乙二醇（PEG）（Mw 4000）均為美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品；羊抗鼠 IgG-HRP酶購(gòu)自北京中杉金橋公司；纖維蛋白原降解物（纖維蛋白解復(fù)合物、D 和 E 片段）由本室制備保存；小鼠骨髓瘤細(xì)胞系（SP2/0）為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水；所用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。SPF 級(jí) BALB/c 純系小鼠，鼠齡 6 ～ 8 周，體重 18 ～ 22 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 儀器 Multiskan MK3 酶標(biāo)儀、BB15 型 CO2培養(yǎng)箱為美國(guó) Thermo 公司產(chǎn)品；SDS-PAGE 電泳儀購(gòu)自北京六一公司；飛測(cè)免疫熒光定量檢測(cè)儀由廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)有限公司研制；高速冷凍離心機(jī)為日本 Hitachi 公司產(chǎn)品；ACL TOP 血凝分析儀為美國(guó) Beckman 公司儀器，D-D 檢測(cè)試劑為西班牙 Werfen Group 產(chǎn)品。

1.1.3 臨床樣品來(lái)源 自 2011年1月至 6月期間，收集江門(mén)市五邑中醫(yī)院門(mén)診病人血漿（枸櫞酸鈉抗凝血，離心收集血漿），共 106 例。D-二聚體含量均經(jīng)血凝儀定值。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立 取 6 ～ 8 周齡的 BALB/c小鼠，首次免疫將福氏完全佐劑與等體積的 D-D 蛋白乳化后于小鼠皮下、足墊處注射，50 μg/只，經(jīng) 3 次加強(qiáng)免疫后，尾靜脈采血，間接 ELISA 法檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，效價(jià)大于104的小鼠，腹腔沖擊免疫 1 次，3 d 后取其脾細(xì)胞制備雜交瘤。細(xì)胞融合按照常規(guī)半固體法進(jìn)行。將離心好的融合細(xì)胞，依次加入 FBS、飼養(yǎng)細(xì)胞、HAT 溶液、半固體培養(yǎng)基，定容至 40 ml，置于混勻儀上混勻 30 min 后，分別倒入30 個(gè)培養(yǎng)皿中，確保半固體均勻貼皿底，裝入濕盒，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 ～ 7 d 后，挑選大小適中的單集落克隆，轉(zhuǎn)入 96 孔板培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)孔面積 50% 后，用間接法檢測(cè)細(xì)胞上清，篩選高效價(jià)的細(xì)胞株進(jìn)行多次亞克隆，確保細(xì)胞株在體外連續(xù)傳代 3 個(gè)月和多次凍存后再?gòu)?fù)蘇仍能穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)定株后常規(guī)制備腹水，采用小鼠體內(nèi)誘生法制備腹水，經(jīng)正辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，制備單克隆抗體。

1.2.2 單克隆抗體的鑒定

1.2.2.1 效價(jià)測(cè)定 單克隆抗體的效價(jià)采用間接 ELISA法測(cè)定。用 D-二聚體蛋白（1 μg/ml）包被 ELISA 板，將抗體稀釋到 1 mg/ml 后，從 1∶1000 濃度開(kāi)始做 10 倍稀釋?zhuān)尤氚逯校?7 ℃ 孵育 1 h，洗滌后加二抗 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠-IgG 反應(yīng)，洗滌后加入 TMB 底物顯色，設(shè)陰性（N）、陽(yáng)性（P）對(duì)照。效價(jià)以 P/N ＞ 2.1 為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2.2 Ig 類(lèi)和亞類(lèi)的鑒定 采用小鼠 mAb 分型試劑盒測(cè)定抗 D-D 單抗的 Ig 亞類(lèi)。依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 mAb 特異性鑒定

1.2.3.1 抗體交叉反應(yīng)性研究 用間接 ELISA 法測(cè)定。將 D-D、纖維蛋白原、纖維蛋白原降解物、D 片段、E 片段包被于 ELISA 微孔板，加入抗體，再加入二抗 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠-IgG，進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.3.2 免疫印跡法測(cè)定單抗特異性 天然狀態(tài)的 D-D為二聚體，且與纖維蛋白原有同源性，故采用非還原蛋白、還原蛋白、纖維蛋白原及其降解片段進(jìn)行檢測(cè)。D-D 分子量約為 200 kD，纖維蛋白原分子量約為 340 kD，降解后片段約 47 ～ 150 kD 不等。因此，為確保纖維蛋白原各片段均轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取 5% 濃縮膠，8%分離膠進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，上樣量 1 μg，并以預(yù)染marker 作示蹤。待 50 kD 條帶達(dá)到分離膠下緣約 3 cm 左右處，停止電泳，進(jìn)行濕轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印條件為 300 mA，4 ℃，恒流轉(zhuǎn)印 2 h，于轉(zhuǎn)印后用麗春紅 S 染色，確認(rèn)轉(zhuǎn)印效果。以 3% BSA封閉，放置 4 ℃ 封閉過(guò)夜。室溫下加一抗孵育 1 h，一抗?jié)舛葹?1 μg/ml，用 PBST 洗滌 4 次，每次10 min；室溫下加二抗，二抗稀釋比例為 1∶20 000，用 PBST洗滌 4 次，每次 10 min，以增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）為底物，進(jìn)行顯影。

1.2.3.3 mAb 親和力測(cè)定 采用非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫試驗(yàn)，參照David Beatty 方法[13]，按公式Ka = (n-1)/2(n[Ab′]t － [Ab]t)計(jì)算親和常數(shù)Ka 值。分別以每孔 0.5、0.25、0.125 μg/ml 的D-D 蛋白包被 ELISA 板，加入倍比稀釋的 mAb，37 ℃作用 30 min 后，加入 1∶20 000 稀釋的 HRP 標(biāo)記羊抗鼠-IgG，37 ℃ 反應(yīng) 30 min，TMB 顯色，測(cè) 450 nmOD值。以 mAb 濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，得到OD值對(duì)抗體濃度的對(duì)數(shù)作圖，以每條曲線上部平坦段的OD值作為 100%，在曲線上查出 50% 的OD值所對(duì)應(yīng)的mAb 濃度，然后按公式計(jì)算出親和常數(shù)。n = [Ag′]t/[Ag]t，[Ag′]t 和 [Ag]t 為不同包被抗原的濃度；[Ab′]t、[Ab]t 是對(duì)應(yīng)不同包被抗原的濃度條件下，將抗體梯度稀釋得到最大吸光度一半處的抗體濃度。

1.2.4 免疫熒光定量方法的建立及臨床應(yīng)用

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將 D-D 蛋白稀釋到 10、5、1、0.5、0.2 和 0.1 μg/ml 濃度，以血凝儀檢測(cè)各定標(biāo)點(diǎn)得到實(shí)際濃度，使用定值后的系列梯度蛋白溶液作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的定標(biāo)濃度及測(cè)得的熒光值確定數(shù)據(jù)處理方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程。

1.2.4.2 臨床初步應(yīng)用 使用篩選到的抗 D-D 配對(duì)抗體建立雙抗體夾心法，利用“飛測(cè)”免疫熒光定量檢測(cè)儀檢測(cè)臨床樣本熒光信號(hào)，將測(cè)得的熒光值代入方程，反求出樣本實(shí)際濃度，并將樣本測(cè)得的濃度與醫(yī)院檢測(cè)濃度對(duì)比，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用直線相關(guān)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析。以 Pearson 乘積矩相關(guān)系數(shù)定量表述線性相關(guān)的程度。P＜ 0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立

經(jīng)過(guò) 4 次細(xì)胞融合，采用間接 ELISA 法進(jìn)行反復(fù)篩選，3 ～ 5 次亞克隆，最終獲得 7 株穩(wěn)定分泌特異性抗 D-D抗體的細(xì)胞株，對(duì)其進(jìn)行亞克隆建株保存。后經(jīng) ELISA 抗體配對(duì)實(shí)驗(yàn)，篩選出 2 株配對(duì)效果好的抗體，命名為 2-6D、4-4C，進(jìn)行以下抗體鑒定分析及臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)。

2.2 抗 D-二聚體單抗的鑒定

2.2.1 效價(jià)測(cè)定 mAb 的效價(jià)采用間接 ELISA 法測(cè)定。結(jié)果顯示，2 株抗體 2-6D 和 4-4C 的效價(jià)分別為 0.321 ×10-6和 0.372 × 10-6。效價(jià)均大于 1∶105。

2.2.2 Ig 類(lèi)和亞類(lèi)的鑒定 經(jīng)小鼠 mAb 分型試劑盒測(cè)定，所獲得的兩株抗 D-D mAb 為 IgG2a 亞類(lèi)。

2.2.3 mAb 特異性鑒定

2.2.3.1 抗體交叉反應(yīng)性研究 結(jié)果顯示，兩株單克隆抗體與纖維蛋白原及其降解物，D 片段和 E 片段不發(fā)生反應(yīng)，與 D 單體有反應(yīng)。

2.2.3.2 免疫印跡法測(cè)定單抗特異性。如圖 1A、圖 1B 所示，兩株 mAb 與非還原的 D-D 蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，與其他蛋白包括還原 D-D 均不反應(yīng)。

圖 1 4-4C（A）與 2-6D（B）抗體免疫印跡分析

2.2.4 mAb 親和力測(cè)定 采用非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫試驗(yàn)，參照David Beatty 方法測(cè)定。兩株單抗與 3 個(gè)不同包被濃度的D-D 蛋白均特異性結(jié)合，經(jīng) Beatty 推導(dǎo)公式，計(jì)算親和常數(shù)，結(jié)果顯示單克隆抗體 2-6D 和 4-4C 的親和常數(shù)分別為9.84 × 10-7和 1.46 × 10-6。結(jié)果見(jiàn)圖 2。

2.3 免疫熒光定量方法的建立及臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將 D-D 蛋白稀釋到 10、5、1、0.5、0.2、0.1 μg/ml 濃度，血凝儀檢測(cè)各定標(biāo)點(diǎn)，得到實(shí)際濃度分別為 10、5.03、1.03、0.53、0.32、0.11 μg/ml。以此系列梯度蛋白溶液作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品，D-D 濃度值為橫坐標(biāo)，熒光檢測(cè)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出，檢測(cè)濃度的線性范圍在 0.1 ～ 10 μg/ml，熒光信號(hào)強(qiáng)度與濃度之間的線性關(guān)系表達(dá)式是 y = 0.0016x3－ 0.0367x2+0.5177x + 0.7892（y 表示熒光信號(hào)強(qiáng)度，x 表示 D-D 濃度）。根據(jù)公式計(jì)算r2 = 0.9996。結(jié)果見(jiàn)圖 3。

圖 2 2-6D（A）與 4-4C（B）親和常數(shù)測(cè)定

2.3.2 臨床初步應(yīng)用 將 2-6D 作為包被抗體，4-4C 為標(biāo)記抗體，采用雙抗體夾心法，檢測(cè)臨床樣本熒光信號(hào)，結(jié)果如圖 4。將測(cè)得的熒光值代入方程，反求出樣本實(shí)際濃度，根據(jù)臨床檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，大于 0.5 μg/ml 判為陽(yáng)性。將樣本測(cè)得的濃度與醫(yī)院檢測(cè)濃度對(duì)比，繪制散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖 5。得出方程 y = 0.7199x + 0.0379。計(jì)算出r2 = 0.9596，P＞ 0.05，兩種方法無(wú)顯著差異。

圖 4 ACL TOP 血凝儀與免疫熒光定量?jī)x（2-6D/4-4C）測(cè)定 106 份臨床樣品 D-D 值

圖 3 應(yīng)用配對(duì)抗體 2-6D/4-4C 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

人體纖溶系統(tǒng)是最重要的抗凝系統(tǒng)，它對(duì)保持血管壁的正常通透性，維持血液的流動(dòng)狀態(tài)和組織修復(fù)起著重要作用。D-D 是纖溶過(guò)程中纖維蛋白降解產(chǎn)物的重要成分，纖溶酶不僅使非交聯(lián)的纖維蛋白單體裂解成肽段，還可使交聯(lián)纖維蛋白降解，釋放出 D、E 碎片，并生成 DD、DD/E、YD/DY、YY/DD 等復(fù)合物，這些碎片進(jìn)一步降解為最小的片段 D-D[1]。

D-D 是交聯(lián)纖維蛋白特異性降解產(chǎn)物，其生成和增高反映了纖溶系統(tǒng)的激活，因此 D-D 交聯(lián)碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。在臨床上已作為血液高凝狀態(tài)和繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)的特異性指標(biāo)應(yīng)用[2-9]。如 D-D 檢測(cè)陰性，可以排除急性靜脈血栓栓塞癥，D-D 陽(yáng)性結(jié)合臨床表現(xiàn)可診斷急性 VTE。此外，D-D 的監(jiān)測(cè)還可反映急性靜脈血栓栓塞癥藥物抗凝溶栓治療的效果以及評(píng)價(jià)復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)程度及預(yù)后。在嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、糖尿病、貧血等疾病進(jìn)展中，均可出現(xiàn)血漿 D-D 水平變化。

圖 5 ACL TOP 法與免疫熒光定量法（2-6D/4-4C）測(cè)定結(jié)果相關(guān)性分析

臨床將 D-D 檢測(cè)指標(biāo)作為體內(nèi)血栓前狀態(tài)及血栓形成的指標(biāo)之一，應(yīng)用越來(lái)越廣泛。但是到目前為止，商品化的 D-D 檢測(cè)手段尚存在一定局限性，試劑質(zhì)量參差不齊，主要以 ELISA 方法和膠乳凝集法為主，市面上的主流產(chǎn)品均以進(jìn)口為主，而其主要生物原材料，即單克隆抗體基本依靠國(guó)外進(jìn)口[14]。本研究采用血漿提取的 D-D 蛋白為免疫原，利用雜交瘤技術(shù)制備篩選出穩(wěn)定分泌特異性抗體的細(xì)胞株，獲得 7 株穩(wěn)定分泌特異性抗 D-D 抗體的細(xì)胞株，經(jīng)鑒定，其中兩株抗體 2-6D 和 4-4C 配對(duì)效果好，其抗體親和力分別為 9.84 × 10-7和 1.46 × 10-6，說(shuō)明其應(yīng)用于診斷試劑的可行性。在特異性鑒定方面，兩株單抗經(jīng)免疫印跡檢測(cè)，與非還原的 D-D 呈陽(yáng)性反應(yīng)，與其他蛋白均無(wú)交叉，提示應(yīng)用于診斷試劑中，兩株抗體滿足靈敏度前提下，能較好地實(shí)現(xiàn) D-D 指標(biāo)檢測(cè)的特異性。

熒光免疫定量檢測(cè)技術(shù)，屬于 POCT 檢驗(yàn)領(lǐng)域新興技術(shù)，能快速、靈敏、簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)指標(biāo)的定量檢測(cè)。POCT 在20 世紀(jì) 90年代得到快速發(fā)展，隨著各種檢測(cè)技術(shù)的興起及檢測(cè)儀器的創(chuàng)新，POCT 的應(yīng)用日益廣泛。免疫熒光技術(shù)屬于以微粒為載體的精確定量免疫分析方法，國(guó)外已有一些公司開(kāi)發(fā)了適用于此平臺(tái)的檢測(cè)試劑及儀器，如 Response公司的 RAMP 檢測(cè)儀，Biosite 公司的 Triage 檢測(cè)儀。開(kāi)展的項(xiàng)目包括心肌梗死，感染類(lèi)標(biāo)志物等。鑒于這些儀器及試劑售價(jià)昂貴，在中國(guó)實(shí)際需要檢測(cè)的項(xiàng)目不一定有產(chǎn)品，因此其應(yīng)用受到一定限制。目前，國(guó)內(nèi)自主研發(fā)的免疫熒光定量檢測(cè)方法的試劑及配套儀器為數(shù)不多，檢測(cè)指標(biāo)則更為局限，目前應(yīng)用較為普遍的是“飛測(cè)”免疫熒光檢測(cè)儀，該系統(tǒng)是由一個(gè)熒光讀數(shù)儀和檢測(cè)板組成，檢測(cè)板使用的是層析法，樣本中的目標(biāo)物在移動(dòng)過(guò)程中與標(biāo)記抗體形成免疫復(fù)合物，通過(guò)檢測(cè)區(qū)域、質(zhì)控區(qū)域的值與目標(biāo)物不同的濃度獲得定標(biāo)曲線，檢測(cè)樣本中的濃度，現(xiàn)階段尚未有成功應(yīng)用于臨床的 D-D 免疫熒光定量檢測(cè)試劑上市。本研究利用國(guó)內(nèi)已上市的飛測(cè)熒光免疫定量檢測(cè)儀器平臺(tái)基礎(chǔ)，研制 D-D免疫熒光定量檢測(cè)試劑。本研究嘗試建立 D-D 的免疫熒光定量檢測(cè)方法，其一，可實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵生物原材料自主提供，其二，也是更為關(guān)鍵的，可填補(bǔ)國(guó)內(nèi)免疫熒光定量檢測(cè) D-D方法學(xué)的空白，為臨床相關(guān)疾病的診斷、治療、監(jiān)測(cè)提供有效工具與手段。

本研究篩選的 2 株單抗具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以用于免疫熒光定量方法學(xué)及 ELISA、Western blot中。通過(guò)檢測(cè)臨床樣品發(fā)現(xiàn)我們開(kāi)發(fā)的 D-D 檢測(cè)試劑分析靈敏度可達(dá)到 0.1 μg/ml，與對(duì)照方法比較，r2= 0.95，兩者相關(guān)性好。在檢測(cè) 106 例臨床樣品中，我們建立的免疫熒光定量方法與對(duì)照方法（比濁法）比較，存在高值偏低現(xiàn)象，考慮是與膠乳標(biāo)記工藝相關(guān)，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將調(diào)整膠乳標(biāo)記蛋白的工藝，期望獲得改善。

[1]Medved L, Nieuwenhuizen W.Molecular mechanisms of initiation of fibrinolysis by fibrin.Thromb Haemost, 2003, 89(3):409-419.

[2]Castro DJ, Pérez-Rodríguez E, Montaner L, et al.Diagnostic value of D dimer in pulmonary embolism and pneumonia.Respiration, 2001,68(4):371-375.

[3]Kesieme E, Kesieme C, Jebbin N, et al.Deep vein thrombosis: a clinical review.J Blood Med, 2011, 2:59-69.

[4]Thachil J, Fitzmaurice DA, Toh CH.Appropriate use of D-dimer in hospital patients.Am J Med, 2010, 123(1):17-19.

[5]Dempfle CE.Validation, calibration, and specificity of quantitative D-dimer assays.Semin Vasc Med, 2005, 5(4):315-320.

[6]Geske JB, Smith SB, Morgenthaler TI, et al.Care of patients with acute pulmonary emboli a clinical review with cardiovascular focus.Expert Rev Cardiovasc Ther, 2012, 10(2):235-250.

[7]Mytnik M, Stasko J.D-dimer, plasminogen activator inhibitor-1,prothrombin fragments and protein C - role in prothrombotic state of colorectal cancer.Neoplasma, 2011, 58(3):235-238.

[8]Sarig G, Klil-Drori AJ, Chap-Marshak D, et al.Activation of coagulation in amniotic fluid during normal human pregnancy.Thromb Res, 2011, 128(5):490-495.

[9]Tomonaga Y, Gutzwiller F, Lüscher TF, et al.Diagnostic accuracy of point-of-care testing for acute coronary syndromes, heart failure and thromboembolic events in primary care: a cluster-randomised controlled trial.BMC Fam Pract, 2011, 12:12.

[10]Tripodi A.D-dimer testing in laboratory practice.Clin Chem, 2011,57(9):1256-1262.

[11]Geersing GJ, Janssen KJ, Oudega R, et al.Excluding venous thromboembolism using point of care D-dimer tests in outpatients: a diagnostic meta-analysis.BMJ, 2009, 339:b2990.

[12]Liu XG, Fang C, Liu Z, et al.Principle and practice of POCT.Beijing:China Medical Science Press, 2006.劉錫光, 方成, 劉忠, 等.POCT 基本理論和臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2006.

[13]Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG.Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay.J Immunol Methods, 1987, 100(1-2):173-179.

[14]Fukuda T, Kasai H, Kusano T, et al.A rapid and quantitative D-Dimer assay in whole blood and plasma on the point-of-care PATHFAST analyzer.Thromb Res, 2007, 120(5):695-701.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.013

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2011ZX09506-001）

510640 廣州，華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院（康可人、盧艷華）；510663 廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)有限公司國(guó)家地方聯(lián)合自檢型快速檢測(cè)工程實(shí)驗(yàn)室（康可人、吳培鈿、張健、唐時(shí)幸、王繼華）

康可人，Email：keren_kang@hotmail.com

2012-02-16