可溶性B7-H4在早期胃癌中的診斷價值探討①

華建江 陳 望 姜 健 楊慶偉 徐志康 梁巧玲

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院檢驗科，深圳518104)

可溶性B7-H4在早期胃癌中的診斷價值探討①

華建江 陳 望 姜 健②楊慶偉 徐志康 梁巧玲

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院檢驗科，深圳518104)

目的:探討可溶性B7-H4(soluble B7-H4，sB7-H4)在早期胃癌中的診斷價值。方法:應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)夾心法檢測80例早期胃癌患者與50例正常人血清sB7-H4水平，用化學(xué)發(fā)光法檢測血清CEA、CA19-9水平，利用受試者工作特性曲線(ROC)，比較分析sB7-H4作為早期胃癌血清標(biāo)志物的診斷價值。結(jié)果:早期胃癌患者血清sB7-H4水平(47.61 ±13.57)ng/ml明顯高于正常人(30.62 ±8.65)ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。sB7-H4 在早期胃癌診斷中的靈敏度(81.25%)和準(zhǔn)確性(78.46%)均高于CEA及CA19-9，特異性(74%)低于CEA及A199。結(jié)論:sB7-H4在早期胃癌診斷中具有良好的臨床應(yīng)用前景，聯(lián)合檢測sB7-H4、CEA和CA19-9可提高胃癌的診斷率。

胃癌;B7-H4;ELISA;受試者工作特性曲線

胃癌是死亡率最高的惡性腫瘤之一，早診斷、早治療是提高胃癌生存率的最有效手段。目前臨床常用的血清標(biāo)志物CEA、CA19-9的特異性和靈敏度較低，被認(rèn)為缺乏早期診斷價值[1]。B7-H4是最新發(fā)現(xiàn)的B7家族成員，它在抗原特異性的免疫反應(yīng)中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用[2，3]。利用免疫組織化學(xué)染色方法，業(yè)已發(fā)現(xiàn)B7-H4在各種腫瘤組織中均有過度表達(dá)，如結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌等。B7-H4可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞膜上和胞漿內(nèi)，還可以可溶性形式存在于血清中，且有實驗證明了宮頸癌、食管癌患者血清中可溶性B7-H4(sB7-H4)水平的增高[4，5]。本研究用雙抗體 ELISA 夾心法[6]，定量檢測早期胃癌患者血清中 sB7-H4水平，比較分析sB7-H4與CEA、CA19-9在靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度上的差異，探討sB7-H4在早期胃癌診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 80例早期胃癌(均經(jīng)臨床診斷和病理診斷確診)標(biāo)本來自2008年6月至2011年12月廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院腫瘤科和普外科的住院和門診患者，其中男49例，女31例，年齡17～84歲。正常人50例，均為經(jīng)本院體檢健康的志愿者，其中男32例，女18例，年齡22～71歲。

1.2 試劑和儀器 酶聯(lián)微量反應(yīng)板(Cloning公司)，抗人B7-H4單克隆抗體(eBioscience公司)，兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體(由廣東醫(yī)學(xué)院臨床免疫學(xué)教研室制備)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，TMB底物及顯色劑(沈陽惠民公司)。癌胚抗原(CEA)、糖鏈抗原19-9(CA19-9) (美國貝克曼原裝試劑)。BOTEK Elx800型酶標(biāo)儀，ACCESS2化學(xué)發(fā)光儀等。

1.3 雙抗體夾心ELISA法 檢測可溶性B7-H4雙抗體夾心ELISA法的建立參見文獻(xiàn)[6]。采用抗人B7-H4 mAb包被酶標(biāo)板，F(xiàn)CS封閉。在包被好的酶標(biāo)板中加入待測血清標(biāo)本，用重組小鼠B7-H4蛋白作為參考標(biāo)準(zhǔn)品，37℃作用1小時，加入稀釋的兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體，用PBST洗3次，再加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，加顯色底物，以硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測A450值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算未知樣品的濃度。

1.4 標(biāo)本收集和檢測所有患者和正常人在早上空腹采血，分離血清后放－70℃保存。采用上述建立的ELISA法對所有樣本在同一批內(nèi)進(jìn)行檢測，每個樣本設(shè)立兩個平行孔，取平均A值計算樣本中sB7-H4的含量(ng/ml)，同時上機檢測所有患者和正常人血清CEA、CA19-9含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)值用±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 早期胃癌患者和正常人血清 sB7-H4、CEA、CA19-9水平 與正常人相比，早期胃癌患者血清中sB7-H4、CEA、CA19-9水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，該結(jié)果提示，sB7-H4在胃癌早期診斷中具有潛在應(yīng)用的價值。

2.2 sB7-H4與 CEA、CA19-9相關(guān)性分析 將80例早期胃癌患者血清 sB7-H4水平分別與 CEA、CA19-9水平進(jìn)行單因素直線相關(guān)分析，結(jié)果顯示sB7-H4與 CEA、CA19-9均呈正相關(guān)(r分別為0.496 和0.506，P 均 ＜0.01)。

表1 胃癌患者和正常人三種血清標(biāo)記物水平比較(±s)Tab.1 The comparison of three kinds of serum marker levels in early gastric cancer patients and normal people(±s)

表1 胃癌患者和正常人三種血清標(biāo)記物水平比較(±s)Tab.1 The comparison of three kinds of serum marker levels in early gastric cancer patients and normal people(±s)

Note:There was significant difference between early gastric cancer patients and normal people，1)P ＜0.01.

Groups nsB7-H4(ng/ml)CEA(ng/ml)CA19-9(IU/L) Early gastric Cancer patients 80 47.61 ±13.57 10.38 ±7.54 40.88 ±20.79 Normal people50 30.62 ±8.651)3.71 ±2.121)23.83 ±16.541)

2.3 早期胃癌患者血清sB7-H4、CEA、CA19-9曲線下面積比較 利用受試者工作特性曲線(ROC)測得sB7-H4對應(yīng)產(chǎn)生的曲線下面積(AUC)為0.857 (95%可信區(qū)間為0.793～0.921)，大于 CEA 的0.734(95%可信區(qū)間為0.646～0.821)和CA19～9的0.805(95%可信區(qū)間為0.728 ～0.881)，如圖1。

2.4 早期胃癌患者血清sB7-H4、CEA、CA19-9診斷效率比較(%) 通過ROC曲線分析，sB7-H4的最佳診斷值為34.71 ng/ml，它在早期胃癌診斷中的靈敏度(81.25%)和準(zhǔn)確性(78.46%)均高于CEA及CA19-9，特異性(74%)低于 CEA及 A199，CEA和CA19-9單項檢測時的陽性率都比較低，而聯(lián)合檢測sB7-H4、CEA和CA19-9可將早期胃癌的診斷率提高至90%。

圖1 早期胃癌患者血清sB7-H4、CEA、CA19-9曲線下面積比較Fig.1 The comparison of the area under the curve (AUC)of sB7-H4，CEA and CA19-9 in early gastric cancer patients

表2sB7-H4、CEA、CA19-9診斷效率比較(%)Tab.2 The comparison of diagnostic efficiency of sB7-H4，CEA and CA19-9 in early gastric cancer patients (%)

3 討論

胃癌的發(fā)病率及死亡率始終居消化系統(tǒng)惡性腫瘤之前列，目前胃癌診斷后的5年生存率仍低于20%。胃癌早期癥狀不明顯，且缺乏有效的普查方法，84.5% 的胃癌患者就診時已處于中、晚期[7]。因此，尋找新的分子標(biāo)志物依然是胃癌診斷和治療的研究熱點之一。

目前，國內(nèi)有關(guān)B7-H4與腫瘤關(guān)系的研究越來越多，已證實大多數(shù)腫瘤組織均高表達(dá)B7-H4，如前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌等等[8-10]，幾乎涵蓋了腫瘤的各個領(lǐng)域。眾多的研究表明，B7-H4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要作用，可為腫瘤的診斷和治療提供一種新的靶位點，具有良好的臨床應(yīng)用前景。然而，目前對B7-H4的研究大多采用Western blot和免疫組織化學(xué)染色的方法，操作繁鎖，只能定性研究B7-H4在腫瘤組織中表達(dá)情況，難比較手術(shù)前后病人B7-H4含量的變化。Simon等[11]在2006年發(fā)現(xiàn)了以可溶性形式存在于血清中的B7-H4(sB7-H4)，且顯示了sB7-H4輔助CA125診斷卵巢癌的優(yōu)越性。

本項目用前期研究中建立的雙抗體夾心ELISA法，定量檢測80例早期胃癌患者血清中sB7-H4水平，同時與消化系統(tǒng)惡性腫瘤常用的輔助診斷指標(biāo)CEA、CA19-9作對比，比較分析三者在靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度上的差異，以探討sB7-H4在早期胃癌診斷中的價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清sB7-H4水平明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。直線相關(guān)分析顯示，sB7-H4與CEA、CA19-9均呈正相關(guān)，提示sB7-H4初步具備胃癌血清標(biāo)志物的潛質(zhì)。利用受試者工作特性曲線(ROC)測得sB7-H4對應(yīng)產(chǎn)生的曲線下面積(AUC)為0.857，大于CEA的0.734 和 CA19-9 的 0.805，與 Simon 等[11]測得sB7-H4在卵巢癌對應(yīng)的曲線下面積(0.86)結(jié)果較一致。此結(jié)果說明，雖然三者在早期胃癌的診斷中均有一定的準(zhǔn)確性，但sB7-H4的準(zhǔn)確性要稍高于CA19-9和CEA。據(jù)報道，血清CEA檢測對胃癌的靈敏度為33.3% ～70.4%，特異性為83.5% ～85.7%[12，13]，血清 CA19-9 的靈敏度為 18.75% ～60%，特異度為 80% ～85%[12-15]，本研究測得 CEA和CA19-9的靈敏度較低，分別為38.75%、45%，這可能是CEA和CA19-9被認(rèn)為缺乏早期診斷價值的原因。sB7-H4的靈敏度、準(zhǔn)確度分別為81.25%、78.46%，均明顯高于CEA和CA19-9，而特異度僅為74%，低于 CEA的 80%和 CA19-9的92%，提示sB7-H可能是一個廣譜的腫瘤標(biāo)志物。盡管三種血清標(biāo)志物均具有一定的診斷價值，但sB7-H4的診斷效率要高于CEA和CA19-9。CEA和CA19-9單項檢測時的陽性率都比較低，而聯(lián)合檢測sB7-H4、CEA和CA19-9可將早期胃癌的診斷率提高至90%。因為腫瘤的發(fā)生是多基因、多步驟改變的結(jié)果，也是多靶點、多環(huán)節(jié)的調(diào)控過程，聯(lián)合檢測正成為該領(lǐng)域一個重要的探索方向，能彌補單項檢測的不足，可明顯提高早期胃癌的診斷率。

綜上所述，本研究表明sB7-H4在早期胃癌診斷中具有良好的臨床應(yīng)用前景，但尚需做以下的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實:(1)目前對于B7-H4的受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚未明確[16]，尚不清楚sB7-H4來源于何處，以及sB7-H4能在多大程度上代表體內(nèi)總的B7-H4含量;(2)對B7-H4分子表達(dá)的調(diào)控機制有待進(jìn)一步明確。

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[收稿2011-11-20 修回2012-04-20]
(編輯 許四平)

The research on diagnosis value of soluble B7-H4 in early gastric cancer

HUA Jian-Jiang，CHEN Wang，JIANG Jian，YANG Qing-Wei，XU ZHi-Kang，LIANG Qiao-Ling.Department of Laboratory Medicine，Shenzhen Shajing Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Shenzhen 518104，China

Objective:To discuss the diagnosis value of soluble B7-H4(sB7-H4)in early gastric cancer.MethodsUsing ELISA sandwich method，the serum level of soluble B7-H4 was detected in 80 cases of early gastric cancer patients and 50 cases of normal people，Chemiluminescence method was adopted to determine the serum CEA and CA19-9 levels ，then analyzed the diagnosis value of sB7-H4 in early gastric cancer with ROC(Receiver Operating Characteristic).ResultsThe serum level of soluble B7-H4 in early gastric cancer patients [(47.61 ±13.57)ng/ml]was significantly higher than that in normal people[(30.62 ±8.65)ng/ml]，there was significant difference within them(P ＜0.01).The sensitivity(81.25%)and accuracy(78.46%)of sB7-H4 in early gastric cancer was higher than CEA and CA19-9，but the specificity(74%)was lower than CEA and CA19-9.ConclusionSoluble B7-H4 have good prospects in clinical application on diagnosing early gastric cancer，detecting the serum levels of sB7-H4，together with CEA and CA19-9 can raise the positive rate of early gastric cancer.

Gastric neoplasms;B7-H4;ELISA;Receiver Operating Characteristic(ROC)

R735.2

A

1000-484X(2012)08-0745-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.016①本文為深圳市科技計劃項目(No.200803231)和深圳市寶安區(qū)科技計劃項目(No.2008174)

②深圳市福田區(qū)中醫(yī)院檢驗科，深圳518000

華建江(1973年－)，男，碩士，副主任技師，主要從事血液疾病檢驗方面的研究。