吖啶紅-羅丹明B體系光度法測定馬蹄皮提取物清除羥自由基作用*

張曉鶴，謝 紅，張泗達，柳 維，林慶宇

（1.四川大學，四川 成都 610064；2.賀州學院，廣西 賀州542800）

人體在各種生命活動的氧化代謝過程中不斷產生大量自由基，而自由基的過氧化反應可導致細胞生理的諸多病理變化，如引發炎癥，損傷膜結構及功能，引發器官癌變等[1]。羥自由基（OH·）是最活潑的活性氧自由基之一，更容易加速細胞衰老，嚴重危害身體健康。利用安全、無毒的天然抗氧化劑可以清除活性自由基[2-4]，因此，探尋快速的對自由基清除作用有識別能力的檢測方法對于離體篩選抗氧化劑，并進一步研究自由基的生物作用具有重要意義。檢測自由基最常利用的是有色染料褪色光度法[5]，該法操作簡便，儀器簡單，成本低。但由于Fenton反應產生的羥自由基本身存在著不穩定性[6]，導致采用單一染料的褪色光度法普遍存在靈敏度不高，結果重現性差的缺點[7，8]。因此，研究高靈敏和高穩定性的測定天然成分抗氧化能力的新體系對于天然抗氧化物的研究有重要意義。

本文研究發現，酸性介質中，Fenton反應產生的羥自由基能迅速氧化吖啶紅-羅丹明B混合染料使其褪色，通過監測吸光度值的變化，研究體系對自由基捕捉的能力，最后對不同溶劑馬蹄皮提取物的抗氧化能力進行了篩選。

1 實驗部分

1.1 儀器與主要試劑

723型分光光度計（上海精密儀器廠）；pHS-2C型精密酸度計（上海雷磁）；501型恒溫器（江蘇實驗儀器廠）；旋轉蒸發儀（上海亞榮）。

1.2×10-5mol·L-1吖啶紅（Acridine Red） 水溶液；4.8×10-5mol·L-1羅丹明 B（Rhodamine B）水溶液；5.0×10-3mol·L-1十二烷基苯磺酸鈉（DBS）水溶液；0.4 mol·L-1H2SO4溶液；4×10-4mol·L-1FeSO4溶液，H2O2（質量分數0.3%）。

馬蹄皮活性成分的提取：馬蹄皮收集于白馬蹄收購點，剔除有腐跡者，洗凈，自然風干后，于恒溫鼓風干燥箱37℃下恒溫干燥24h，粉碎，過100目篩，稱取10g置于浸提灌中，加入40%乙醇溶液250mL，水浴（40℃）浸提 12h，趁熱減壓抽濾，濾渣再重復提取一次，合并兩次濾液，旋轉蒸發得馬蹄皮乙醇提取物，用時配置5mg·mL-1提取液使用。采用相同方法可得水、甲醇及乙酸乙酯提取物。

1.2 實驗方法

1.2.1 羥自由基的測定 取2支10mL具塞比色管，在一支中加入吖啶紅、羅丹明、DBS溶液、H2SO4溶液各1.0mL，在另一支中加入吖啶紅溶液、羅丹明溶液、DBS 溶液、H2SO4溶液、FeSO4溶液、H2O2溶液各1.0mL，分別用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，反應30min后，以蒸餾水為參比，在556nm處測定吸光度，分別記為Aa、Ab，則自由基產生量可用ΔA=Aa-Ab表示。

1.2.2 馬蹄皮抗氧化能力測定 在1.2.1體系中，未加Fenton試劑及馬蹄皮提取物體系的吸光度記為A1；未加馬蹄皮提取物體系的其吸光度記為A2；加入馬蹄皮提取液1.0mL后，測定體系的吸光度為A3，按以下公式計算馬蹄皮對羥自由基的清除率：

2 結果與討論

2.1 不同體系的吸收光譜曲線

研究了酸性條件下混合體系吸光度的變化（圖1），結果表明，在表面活性劑DBS存在的情況下，混合體系存在離子締合過程，體系的最大吸收波長發生紅移，出現在556nm處；同時吸光度較單一體系都有值有明顯的增加。

圖1 不同體系的吸收曲線Fig.1 Absorbance curve of different system

按實驗方法配制空白溶液及羥自由基反應體系，在特定波長范圍內掃描，得吸收光譜曲線見圖2。

圖2 混合體系吸收曲線Fig.2 Absorbance at different wavelengths of Acridine Red and Rhodamine B system

由圖2可見，由于被羥自由基氧化褪色，混合染料體系吸光度顯著降低（圖2 b），實驗過程中通過與單一體系對比，發現自由基對混合體系的褪色程度明顯，吸光度的變化更大，表明其對自由基的捕捉靈敏。

2.2 反應條件的選擇

2.2.1 酸度的影響 以ΔA為反應條件選取的依據，考察了酸度對測定的影響，結果表明在H2SO4溶液濃度為0.4 mol·L-1的時候，體系具有較高且穩定的ΔA值。故選擇濃度為0.4mol·L-1的H2SO4。

2.2.2 吖啶紅與羅丹明濃度比的確定 考慮到單一成分的濃度比對混合體系的吸光度的影響，當吖啶紅與羅丹明濃度比為 1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8的時候有較高吸光度，但在 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8時體系吸光度很不穩定，故選擇吖啶紅與羅丹明濃度比1∶4作為最佳。此時兩者濃度分別為1.2×10-5mol·L-1和 4.8×10-5mol·L-1。

2.2.3 反應時間的選擇 在上述選定的自由基測定反應體系中，30min內，ΔA值隨反應時間的增加而明顯增大，但45min后增幅很小，體系基本穩定。故選擇反應開始后的第30 min為最佳反應時間。

2.2.4 DBS用量 DBS用量實驗表明，DBS濃度為5.0×10-3mol·L-1時ΔA值最高且穩定，因此，后續實驗選擇加入DBS濃度為5.0×10-3mol·L-1。

2.2.5 FeSO4用量的影響 按實驗方法，加入不同濃度的FeSO4溶液，測出ΔA。當FeSO4溶液濃度為4×10-4mol·L-1時，ΔA較大且測量誤差較小，故選用 4×10-4mol·L-1的 FeSO4溶液。

2.2.6 H2O2用量與ΔA的關系 加入不同質量分數的H2O2溶液，計算△A值，結果表明，隨著H2O2濃度的增加，△A增大，當加入0.3%的H2O21.0 mL時，△A基本不變，所以選擇加入0.3%H2O21.0 mL。

2.3 混合體系的穩定性

在最大吸收波長處，測定了80 min內吖啶紅-羅丹明B混合體系的吸光度，結果見圖3。

圖3 混合體系穩定性Fig.3 Effect of time on the system stability

由圖3可知，體系吸光度值在80min內最大波動為0.07，證明體系穩定性較好。

2.4 方法重現性

按實驗方法配制11份產生羥自由基的溶液進行重現性實驗，相對標準偏差為2.82%，說明方法穩定性較好。

2.5 抗氧化劑清除·OH作用的測量

測定了3種抗氧化劑對·OH的清除率（圖4）。以驗證方法的有效性。

圖4 人工抗氧化劑對自由基的清除作用Fig.4 Relationship between the volume of antioxidant and scavenging activity

圖4結果表明，BHT、硫脲、抗壞血酸的抗氧化活性較好；且隨抗氧化劑用量的增加，清除率加大，說明對·OH的清除作用與抗氧化劑的用量具有明顯的量效關系，此結果和文獻順序一致[9，10]。因此，可用本法確定提取物活性成分的抗氧化能力。

此外，考察了自由基反應體系在加入馬蹄皮乙醇提取液后吸光度的變化，結果見圖5，在加入馬蹄皮乙醇提取液后，體系褪色程度減弱，吸光度增大（圖5 b），說明馬蹄皮提取物對羥自由基具有明顯的清除作用，可作為天然抗氧化劑進行開發利用。

圖5 提取物清除自由基吸收曲線Fig.5 The absorbance at different wavelengths of Acridine Red and Rhodamine B system

應用該混合體系對馬蹄皮不同提取物的抗氧化能力進行測定，結果見圖6。

圖6 馬蹄皮不同提取液清除羥自由基的能力Fig.6 Scavenging capacity of extraction by various solvents toward hydroxyl radical.

由圖6可見，在最大體積下，不同提取物的清除率次序為乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物＞水提取物，表明馬蹄皮乙醇提取物對羥自由基具有較好的清除作用。

3 結論

在表面活性劑存在下的酸性介質中，Fenton反應產生的羥自由基能迅速氧化吖啶紅-羅丹明混合染料體系使其褪色，根據馬蹄皮提取物對羥自由基的清除作用，使混合染料褪色程度降低，據此建立測定天然產物抗氧化能力的新方法，方法具有較好選擇性和穩定性，可以應用于判斷天然提取物的抗氧化能力。應用此體系對馬蹄皮提取物的抗氧化能力進行了測定，證明馬蹄皮提取物對羥自由基具有明顯的清除作用，清除率次序為乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物＞水提取物，可將其作為天然抗氧化劑進行開發利用。

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