鏈霉菌182－2抗真菌活性物質的分離及抑菌特性的初步研究

高 芬， 盧賽飛， 王夢亮

（山西大學應用化學研究所，太原 030006）

植物病原真菌是危害農作物的主要病原微生物類群，給農業生產造成巨大的損失［1］。目前，化學農藥在控制植物病害造成的損失上仍起著主要作用。但是化學農藥的大量使用，已經對人類環境造成了嚴重的危害，并且增加了病害的抗藥性［2］。從天然資源中尋找活性物質代替化學農藥和使用天然抗菌化合物保護作物已成為當前研究的重點［3］。鏈霉菌182－2（Streptomyces sp．182－2）產生一種抗真菌抗生素，其發酵液具有較廣的抗菌譜，生物活性明確、高效，具有開發為工業化產品的價值，所以有必要對其進行分離純化。由于該抗菌活性組分具有水溶性好的特點，用一般的有機溶劑萃取的方法不能從發酵液中將其有效地提取出來［4］。而用大孔吸附樹脂提取抗生素多有報道，且此方法具有吸附容量大、吸附速度快、易解吸、易再生等優點［5－6］，所以本試驗采用的方法為活性炭脫色、大孔吸附樹脂柱層析純化等方法對鏈霉菌182－2產生的抗真菌活性物質進行了初步純化，并對其抑菌特性進行了初步研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 供試菌株

鏈霉菌182－2菌株由本實驗室保存；煙草赤星病菌［Alter naria alter nata （Fries）Keissler］由中國農業科學院煙草研究所惠贈。

1．1．2 主要儀器和材料

儀器：DHL－A電腦恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）。電腦自動部分收集器DBS－100（上海青浦滬西儀器廠）。HD－9704紫外檢測儀（上海精科實業有限公司）。

試劑：大孔吸附樹脂：X－5、H103、AB－8購自南開大學化工廠，XAD16、XAD7購自北京慧德易?；钚蕴浚嘿徸孕氯A活性炭廠。

1．2 發酵液的預處理

發酵液用草酸（0．5 mol／L）調p H3．0，60℃保溫30 min，然后6 000 r／min離心10 min沉降，取上清液加入等量預冷丙酮，混合均勻后，將混合液在水浴中緩緩加熱至50℃，維持10 min，冷卻至室溫，再次6 000 r／min離心10 min去除沉淀，上清旋轉蒸發去掉丙酮［4］。

1．3 抑菌活性測定方法

采用牛津杯法［7］。將活化的煙草赤星病菌制成孢子懸液（10×15倍下，10～20個／視野），吸取300μL加入70 mL熔融態PDA培養基，制成混菌平板。等距離放置牛津杯，用移液槍往每個牛津杯中加200μL粗提液，28℃恒溫培養48 h后十字交叉法測量抑菌圈直徑，下面所有抑菌試驗均設3次重復，以無菌蒸餾水為對照。

1．4 活性炭吸附法純化抗菌活性物質

1．4．2 活性炭的篩選

稱取處理好的1．5 mm柱狀活性炭、4 mm柱狀活性炭、粉末狀活性炭和顆粒狀活性炭各1 g，放入三角瓶中，加預處理的發酵液4 mL，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃）。測吸附余液抑菌活性。

1．4．2 洗脫劑及濃度的選擇

取吸附后的1．5 mm柱狀活性炭平均分裝于4個三角瓶中，分別加入50%、60%和70%的丙酮，及80%乙醇各4 mL，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃）。測洗脫液抑菌活性。

1．4．3 1．5 mm柱狀活性炭純化抗菌活性物質

依據上述試驗篩選的條件，取1．5 mm柱狀活性炭50 g，放入三角瓶中，加100 mL預處理的發酵液，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃）。吸附完后用等體積的50%的丙酮洗脫，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃）。測量洗脫液抑菌活性，并旋轉蒸發，冷凍干燥。

1．4．4 活性炭脫色效果的測定

將經活性炭處理過的抗菌活性物質稀釋成不同濃度，在480 nm處測吸光值，對其進行線性回歸，得回歸方程y＝0．049 9x＋0．034 8，r2＝0．998 9，線性關系良好。于480 nm處測定粗提液吸收值，以吸光度值表示溶液色度的大小。依據公式：脫色率＝（脫色前色度－脫色后色度）／脫色前色度×100%，計算脫色率［8］。

1．5 大孔樹脂吸附法純化抗菌活性物質

1．5．1 樹脂的篩選

取經過預處理的大孔吸附樹脂H103、X－5、AB－8、XAD7、XAD16各1 g，放入三角瓶中，分別加入6 mL的2 mg／mL的粗提液，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃），測吸附余液活性。

1．5．2 洗脫劑的篩選

將吸附后的H103樹脂傾去余液，平均置于6個三角瓶中，加入50%、80%甲醇；50%、75%乙醇；50%、75%丙酮各6 mL，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃），測洗脫液抑菌活性。

1．5．3 洗脫流速對洗脫效果的影響

用吸附飽和的大孔吸附樹脂H103制備層析柱3根（2．0 c m×40 c m），然后用50%的丙酮160 mL洗脫，流速分別為1．0、1．5、2．0 mL／min，流出液每4 mL收集一管。分別測定各管收集液在254 n m下的紫外吸收值。

1．5．4 H103樹脂柱層析純化抗菌活性物質

H103樹脂經過預處理后裝柱（2．0 c m×40 c m），3倍體積去離子水平衡。上樣20 mL（濃度2 mg／mL），流速0．5 mL／min。上樣完畢，用去離子水80 mL快速沖洗未完全吸附的活性物質后，50%的丙酮洗脫，洗脫體積160 mL，流速1．0 mL／min。分部收集洗脫液，4 mL／管。紫外吸收法和牛津杯法分別檢測每管洗脫液的紫外吸收和抑菌活性，并繪制洗脫曲線。合并同一洗脫峰中活性高的洗脫液，并將合并液旋轉蒸發，冷凍干燥。

1．6 抗菌活性物質對煙草赤星病菌的作用方式

1．6．1 對煙草赤星病菌的抑制作用

將煙草赤星病菌的孢子（10×15倍下，10～20個孢子每視野）制成混菌平板，混菌平板制作同1．3。分別加入經H103樹脂純化后的活性物質，使其終濃度分別為125、250、500、1 000μg／mL和2 000μg／mL，做抑菌活性測定，并在顯微鏡下觀察菌絲形態變化。

1．6．2 對煙草赤星病菌的抗生作用

將300μL煙草赤星病菌孢子液（10×15倍下，10～20個孢子每視野）加入30 mL PD培養液中，28℃恒溫培養24 h至長出均勻可見菌絲后，將活性物質加入培養液，使其終濃度分別為10、20、40、80、160μg／mL和320μg／mL。繼續培養24 h，肉眼觀察未見菌絲生長的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。然后將菌絲撈出，無菌水充分沖洗，重新放入未加活性物質的PD培養液30 mL中，再培養48 h，肉眼觀察未見菌絲生長的最低濃度為最小殺菌濃度（MBC）［9］。

1．6．3 對煙草赤星病菌菌絲生長速率的影響

將活性物質加入定量裝好的熔融態PDA培養基內，使其終濃度為6．25、12．5、25、50、100μg／mL和200μg／mL，制成含毒平板，再將培養7 d的病菌制成菌餅（直徑6 mm），接入含毒平板中央，28℃恒溫培養。于24、48、72 h時十字交叉法測菌餅的生長情況。計算抑制率和抑菌中濃度（EC50）［10－11］。

1．6．4 對煙草赤星病菌孢子萌發的影響

將活性物質分別配制成一定濃度溶液，取配好的藥液5 mL與孢子懸浮液（20～40個／視野）等體積混合后，使活性物質終濃度分別為6．25、12．5、25、50、100μg／mL和200μg／mL，加入無菌平皿，28℃恒溫培養。24、48、72 h時觀察孢子萌發情況。拍照觀察孢子形態。計算孢子萌發抑制率和抑菌中濃度EC［10－11］50。

上述試驗均以無菌蒸餾水為對照，設3次重復。

2 結果與分析

2．1 發酵液的預處理

發酵液經草酸酸化和丙酮沉淀兩步去除了雜蛋白和其他雜質，牛津杯法測定抑菌活性后，抑菌圈直徑可達38．4 mm。

2．2 活性炭吸附法純化抗菌活性物質條件的篩選

2．2．1 活性炭的篩選

吸附余液的抑菌試驗結果顯示：用1．5 mm柱狀活性炭處理后，吸附余液的抑菌圈直徑最小，用粉末狀活性炭處理后的吸附余液抑菌圈最大（圖1）。說明1．5 mm柱狀活性炭對該活性物質的吸附能力最強。因此，選用1．5 mm柱狀活性炭進行下步試驗。

圖1 經不同活性炭處理后吸附余液的抑菌活性

2．2．2 洗脫劑及濃度的選擇

洗脫劑的選擇結果如圖2所示，1．5 mm柱狀活性炭經50%丙酮、60%丙酮和80%乙醇洗脫后，50%丙酮的洗脫液抑菌活性最強，可達35．0 mm。同時發現，50%丙酮的洗脫液顏色最淺，只有輕微的黃色，可見在這一洗脫條件下，抑菌活性物質被較好地洗脫下來，而色素洗脫下來很少。

圖2 不同洗脫劑洗脫能力的對比

2．2．3 1．5 mm柱狀活性炭純化抗菌活性物質

經活性炭純化后的抗菌活性物質，抑菌圈直徑可達到38 mm。且脫色效果明顯，未經處理的活性物質粗提液，顏色為深黃色，經過處理的活性物質液體較透明澄清，脫色率可達77%。

2．3 大孔樹脂吸附法純化抗菌活性物質

2．3．1 樹脂的選擇

樹脂篩選結果如圖3所示，用H103樹脂處理過的吸附余液的剩余活性最小，而XAD7樹脂處理過的吸附余液活性最大，這說明H103對該活性物質的吸附能力最強。因此，選用H103樹脂為試驗用的樹脂。

圖3 經不同樹脂處理后吸附余液的抑菌活性

2．3．2 洗脫劑的選擇

大孔樹脂吸附活性物質后，用不同溶劑系統洗脫，50%丙酮的洗脫液抑菌活性最大（圖4），說明該溶劑系統可以把活性物質從樹脂上很好地洗脫下來，因此選擇50%丙酮作為大孔樹脂吸附后的洗脫劑。

圖4 不同洗脫劑洗脫能力的對比

2．3．3 洗脫流速對洗脫效果的影響

由圖5可知，洗脫流速對分離效果有一定的影響，洗脫流速為2 mL／min時，洗脫曲線峰形較寬，且伴隨一定程度的拖尾現象，不利于純化。當流速為1 mL／min時，洗脫峰形最窄，洗脫成分相對集中，樣品較好地進行分離。所以本試驗選擇洗脫流速為1 mL／min。

圖5 洗脫流速對洗脫效果的影響

2．3．4 H103樹脂柱層析純化抗菌活性物質

按上述選擇條件進行H103柱層析，以每管收集餾分的抑菌活性和在254 n m下的紫外吸收為檢測指標，在50%丙酮洗脫下均得到2個洗脫峰（圖6），推測至少含有2個活性組分。由于洗脫峰Ⅰ抑菌活性小，且收集量較少，因此主要收集洗脫峰Ⅱ為下步研究對象。

圖6 大孔樹脂吸附法純化抗菌活性物質的洗脫曲線

2．4 抗菌活性物質對煙草赤星病菌的作用方式

2．4．1 對煙草赤星病菌的抑制作用

活性物質的濃度為125μg／mL時，抑菌圈直徑只有13 mm，隨著其濃度的增大，抑菌圈直徑逐漸增大。當活性物質的濃度為2 000μg／mL時，對煙草赤星病菌的抑菌圈直徑可達58 mm。挑取這部分菌絲顯微觀察發現：菌絲顏色加深、節間縮短、變形扭曲并且產生大量泡囊，而對照菌絲生長光滑纖細（圖7）。

圖7 抗菌活性物質對煙草赤星病菌的抑菌作用（400×）

2．4．2 對煙草赤星病菌的抗生作用

試驗結果表明，當活性物質濃度為80μg／mL時，24 h后菌絲未見生長。且隨著活性物質濃度增大，變黑的菌絲逐漸增多。將不再生長的菌絲洗去黏附的抗菌活性物質后，加入不含活性物質的PD培養液中繼續培養48 h，活性物質濃度為160μg／mL，處理過的菌絲沒有生長，所以該抗菌活性物質的 MIC為80μg／mL，MBC為160μg／mL。

2．4．3 對煙草赤星病菌菌絲生長速率的影響

活性物質對煙草赤星病菌菌絲生長有明顯的抑制作用。在相同時間下，抑菌作用隨活性物質濃度的增大而增強；在同一濃度下，48 h時抑制率達到最高，EC50為31．9μg／mL。隨時間的延長，抑制率開始呈降低的趨勢（表1）。

表1 抗菌活性物質對煙草赤星病菌菌絲生長速率的影響

2．4．4 對煙草赤星病菌孢子萌發的影響

抗菌活性物質對煙草赤星病菌孢子萌發有明顯的抑制作用，在不同時間段內，抑制率隨濃度的增大而增大；同一濃度下，48 h時抑制率達到最高，EC50為42．2μg／mL，之后開始下降（表2）。顯微鏡觀測顯示：對照的孢子光滑飽滿，萌發出光滑、細長的菌絲。處理的孢子則表面粗糙、甚至變形，萌發出的芽管受到了不同程度的抑制，有的剛萌發即形成大泡囊；當活性物質濃度為200μg／mL時，出現孢子破裂、原生質體凝集滲漏現象（圖8）。

表2 抗菌活性物質對煙草赤星病菌孢子萌發的抑制作用

圖8 抗菌活性物質對煙草赤星病菌孢子萌發的抑制作用（400×）

3 結果與討論

鏈霉菌182－2發酵液中抗真菌活性組分的抗菌譜較廣，對煙草赤星、番茄早疫和蘋果斑點落葉等病原菌有明顯的抑制作用，具有較好的工業應用價值。針對該抗菌活性物質的理化性質［12］，我們選擇了活性炭脫色法和大孔樹脂吸附法的粗分離［13－14］。結果表明1．5 mm 柱狀活性炭 具 有 較 好的脫色作用，且起到了一定的純化作用。H103大孔吸附樹脂對此活性物質進行分離時，分離效果較好，去掉了大部分的雜質，得到兩個活性峰，說明該抗菌活性物質至少有兩個活性組分。由于活性峰Ⅰ抑菌活性較弱（這可能與收集到的量較少有關系），所以我們選擇活性峰Ⅱ收集，并進行抑菌作用方式的研究。

在離體條件下，采用抑制菌絲生長速率法和抑制孢子萌發等方法表明純化后的活性物質對煙草赤星病原菌具有較強的抑制作用。對該抗菌物質進一步純化以及結構的研究正在進行中，相信該抗菌活性物質會有很好的發展前景。

［1］ 孫強，閆建芳，劉秋，等．放線菌菌株MY02的鑒定及發酵液中抗真菌活性組分的分離［J］．植物保護，2007，33（5）：71－74．

［2］ Van Lenter J C．A greenhouse without pesticides：Factor fantasy［J］．Cr op Pr otection，2000，19：375－384．

［3］ 安德榮．生物制藥的原理及方法—抗生素制備［M］．北京：中國科學文化出版社，2002．

［4］ 高芬，吳元華，魏穎穎，等．拮抗鏈霉菌182－2的抑菌防病作用及抗菌物質的初步鑒別［J］．中國生物防治，2008，24（2）：148－153．

［5］ 顧覺奮．抗生素［M］．上海：上?？茖W技術出版社，2001．

［6］ Chaubal M V，Payne G F，Reynolds C H，et al．Equilibriu m for the adsor ption of antibiotics onto neutral poly meric sorbents：experi mental and modeling studies［J］．Biotech Bioeng，1995，47：215－226．

［7］ 劉翠娟，段琦梅，安德榮．抗真菌拮抗放線菌的篩選及搖床發酵條件的優化［J］．微生物學雜志，2004，24（4）：12－14．

［8］ 宋應華，朱家文，陳葵．紅霉素發酵液大孔樹脂脫色過程研究［J］．中國抗生素雜志，2006，31（7）：408－411．

［9］ 蔣細良，謝德齡，倪楚芳．中生菌素的抗生作用［J］．植物病理學報，1997，27（2）：133－138．

［10］方中達．植病研究方法［M］．第3版．北京：中國農業出版社，1998．

［11］田小衛，龍建友，白紅進，等．一株放線菌次生代謝產物抗菌活性的初步研究［J］．植物保護，2004，30（2）：51－54．

［12］高芬，穆凌霄，魏穎穎，等．煙草赤星病菌拮抗鏈霉菌的多重篩選及發酵液理化性質［J］．華北農學報，2007，22（6）：171－175．

［13］陳寶福，曹云峰，孟書丹．淺析影響活性炭吸附效果的因素［J］．黑龍江醫藥，2004，17（3）：193－194．

［14］姬生寶，范晉勇，元英進．藤黃灰鏈霉菌－H103發酵液中抗真菌成分的分離純化［J］．微生物學通報，2005，32（3）：77－81．