當歸內生真菌抗植物病原菌的活性研究

江 曙， 段金廒， 錢大瑋， 陶金華

（1．南京中醫藥大學藥學院，南京 210046； 2．南通大學醫學院，南通 226019）

內生真菌是指在植物體內完成其生活史的部分或全部，生長于植物組織細胞間，分布于葉鞘、種子、花、莖、葉片和根中，但又不引起任何病癥的微生物，突出強調了內生真菌與植物的互惠共生關系［1］。Selosse等研究表明，被內生真菌感染的植物遭受到真菌病害影響的程度遠遠低于沒有感染內生真菌的植物［2］。由此可見，內生真菌可提高宿主植物對生物脅迫的抵抗能力［3］。

近年來的研究表明，內生真菌是一個多樣性十分豐富的微生物類群，能夠產生一些結構新穎、類型多樣的次生代謝產物，如萜類、生物堿類、芳香類、肽類等化合物，具有較強的抑菌、殺菌活性［4－6］，是臨床抗菌藥物和生物農藥研究與開發的潛在資源，在農業和醫藥領域具有重要的應用前景。目前關于藥用植物內生真菌抗菌活性的研究較少，當歸內生真菌的研究還未見相關報道，本文主要研究當歸內生真菌及其代謝產物的抗菌活性，為進一步尋找天然活性物質及生物農藥提供依據，為植物病原真菌的生物防治以及發展綠色中藥材探索新的途徑。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 供試菌株

當歸內生真菌（分離自當歸新鮮植株），小麥赤霉病菌（Fusariu m gr a minear u m Sch w．），番茄早疫病菌（Alter naria sol ani），番茄灰霉病菌（Botr ytis cinerea），水稻紋枯病菌（Rhizoctonia sol ani），南京中醫藥大學生物制藥教研室保藏。

1．1．2 培養基

PDA培養基［7］；內生真菌發酵培養基：葡萄糖1%，黃豆餅粉2%，淀粉1%，MySO4·7 H2O 0．3%，KH2PO40．3%，NH4Cl 0．3%，自然p H，121℃滅菌30 min。

1．1．3 儀器與設備

高速離心機（TGL－6B，上海安亭科學儀器廠），微量移液器（QYQ，北京金花），旋轉蒸發儀（RE－52A，上海亞榮生化儀器廠）。

1．2 方法

1．2．1 內生真菌的活化

將4℃冰箱中保藏的內生真菌接種到新鮮的PDA斜面上，于28℃培養6～7 d。

1．2．2 內生真菌的發酵及樣品處理

分別挑取內生真菌菌塊接種到含有40 mL發酵培養基的150 mL三角瓶中，于28℃，200 r／min培養5 d。發酵結束后，10 000 r／min離心10 min，上清液于60℃減壓濃縮至4．0 mL，經細菌過濾器過濾后，得無菌濃縮液。

1．2．3 抗植物病原真菌活性的測定［8－9］

1．2．3．1 拮抗試驗

挑取直徑為6 mm的小塊植物病原真菌接種于PDA平板的中央，然后將不同的內生真菌（直徑6 mm）接種在平板四周，于28℃培養6 d，根據抑菌圈的有無及大小判斷是否存在拮抗作用以及拮抗作用的強弱。

1．2．3．2 抑制菌絲生長法

將無菌濃縮液1 mL與9 mL融化的PDA培養基混勻，倒入無菌培養皿中制成帶藥培養基平板。培養基凝固后，放入1個供試菌的菌餅（直徑為6 mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養基表面，重復3次。對照為取1 mL的無菌水與9 mL融化的PDA培養基混勻，其他操作同處理組一致。培養72～96 h后，按下列公式計算抑制率。

菌絲生長抑制率＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）／（對照菌落直徑－6）×100%。

1．2．3．3 抑制孢子萌發法

取供試植物病原真菌的孢子配成適當濃度的孢子懸浮液，在10×10低倍鏡觀察，每個視野有30～40個孢子。將1 mL無菌濃縮液與1 mL孢子懸浮液混合，取1滴滴加在凹玻片上，每處理重復3次。對照為將1 mL的無菌水與1 mL孢子懸浮液混合，其他操作同處理組一致。在25℃下保濕培養，當對照的萌發率達到80%后，檢查所有處理的萌發率。以孢子芽管長度大于孢子短半徑者為萌發。在小麥赤霉病菌孢子液中添加當歸內生真菌提取物后，培養至8 h，而其他3種病原真菌孢子的處理組均培養至10 h后，按下式計算孢子萌發抑制率：

萌發抑制率＝（對照萌發率－處理萌發率）／對照萌發率×100%。

2 結果與分析

2．1 拮抗菌株的初步篩選

將分離于當歸新鮮植株的206株內生真菌分別進行對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌和水稻紋枯病菌的拮抗試驗。結果表明，當歸內生真菌對小麥赤霉病菌和番茄早疫病菌的拮抗作用較為普遍，具有拮抗作用的內生真菌比例分別達到24．3%和28．6%（表1）。

表1 當歸內生真菌對植物病原真菌的拮抗作用

2．2 當歸內生真菌代謝物對植物病原真菌菌絲生長及孢子萌發的抑制作用

采用菌絲生長速率法考察了部分有益內生真菌代謝物對4種植物病原真菌菌絲生長的影響，結果表明，內生真菌 Coccosporell a sp．、Coniosporieae sp．1、Fusell a sp．2和Fusell a sp．3代謝物對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻紋枯病菌生長的抑制作用最強，抑制率分別達到71．6%、62．8%、76．6%和60．7%；此外，Phacidium sp．代謝物對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌以及番茄灰霉病菌均具有較強的抑制活性，Fusell a sp．2代謝物對番茄灰霉病菌和小麥赤霉病菌具有較強的抑制作用（表2）。

采用孢子萌發法考察了當歸內生真菌代謝物對4種植物病原真菌孢子萌發的影響，結果表明，對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻紋枯病菌孢子萌發具有抑制作用的內生真菌比例均超過20%（表3）。其中，以小黏盤孢屬（Myxor mia）、暗梗梭孢霉屬（Coniosporieae）以及束絲孢屬（Ozoniu m）的內生真菌數量較多。My xor mia sp．2和My xor mia sp．4代謝物對4種植物病原真菌孢子萌發的抑制率均達到90%以上，Coniosporieae sp．4、Coniosporieae sp．6 以及 My xor mia sp．7代謝物對小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌孢子萌發抑制作用較強，Coniosporieae sp．7代謝物對小麥赤霉病菌和番茄早疫病菌孢子萌發的抑制活性約為其他2種植物病原菌的一倍（表4）。

表3 抑制4種植物病原真菌孢子萌發的當歸內生真菌的篩選

表4 當歸有益內生真菌代謝物對植物病原真菌孢子萌發的抑制作用

2．3 部分有益內生真菌發酵液活性部位的篩選

將發酵液經過低溫真空濃縮至干，得到的干物質分別采用不同極性的溶劑（石油醚、乙酸乙酯、50%乙醇、水）進行提取，提取液濃縮至干，進行活性檢測。結果表明，乙酸乙酯提取部位對植物病原真菌菌絲體和孢子萌發的抑制作用相對較強，表明在內生真菌的次生代謝產物中非極性、親酯性的活性物質含量較多，但不同的提取部位對植物病原真菌菌絲生長及孢子萌發的整體抑制活性則大大減弱（表5，表6）。

表5 部分有益內生真菌發酵液不同提取部位對病原真菌菌絲生長的抑制作用

表6 部分有益內生真菌發酵液不同提取部位對病原真菌孢子萌發的抑制作用

3 討論

在內生真菌與宿主植物構成的微生態系統中，內生真菌發揮著重要的生態學功能，對植物病原菌的抑菌、殺菌現象較為普遍［10－11］。80%的植物內生真菌在抗真菌、抗藻類或抗雜草等方面具有較強的生物活性，而來自土壤中的真菌大約只有43%具有活性［12］。其抗菌活性主要是由于能夠產生多種多樣的抗菌物質，一些內生真菌產生的生物堿可增強宿主植物的抗病性，抑制病原菌的生長和孢子萌發等［13］。如從衛矛科藥用植物雷公藤（Tripter ygeu m wil for dii Hook F．）中分離的內生菌能產生一種新酰胺生物堿，該物質對稻瘟病菌（Pyricul aria or yzae Cav．）及其他多種植物病原真菌具有較強的抑殺作用［14－15］。從 美 麗 決 明（Cassia spectabilis）的擬莖點霉屬內生真菌Phomopsis cassiae中分離到5個杜松烷倍半萜，其中3，11，12－trihydroxycadalene對球孢枝孢（Cladosporium sphaerosper mum）和枝狀枝 孢 （C．cl adosporioides）的 抑 菌 活 性 最 強［16］。由此可見，在尋找新的天然藥物以及植物病蟲害的防治藥物方面，植物內生真菌將是一個新的資源庫。在本研究中，多數當歸內生真菌對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻紋枯病菌等植物病原真菌具有較強的抑制活性，用不同極性溶劑進行內生真菌次生代謝物質的提取，結果表明內生真菌的活性物質主要存在于乙酸乙酯提取部位。此外，雖然不同提取部位的活性出現了不同程度的降低，但不同提取部位都具有一定的抗菌和抑制植物病原真菌孢子萌發的活性。本研究表明抗植物病原真菌的當歸內生真菌種群具有多樣性，同時其產生的活性物質也具有多樣性的特點，因此藥用植物內生真菌有望成為生物農藥研究與開發的新資源，在植物病蟲害生物防治中將具有較好的應用前景，對于中藥材的栽培生產以及中藥資源可持續利用等方面都具有重要的實踐指導意義和理論價值。

［1］ Pr o mputt ha I，Lu myong S，Dhanasekaran V，et al．A phylogenetic eval uation of whether endophytes beco me saprotr ophs at host senescence［J］．Micr ob Ecol，2007，53（4）：579－590．

［2］ Selosse M A，Baudoin E，Vandenkoornhuyse P．Sy mbiotic microorganisms，a key for ecological success and protection of plants［J］．C R Biol，2004，327（7）：639－648．

［3］ Carroll G C．Fungal endophytes in stems and leaves：fro m latent pat hogen to mutualistic sy mbiont［J］．Ecology，1998，69（1）：2－9．

［4］ Strobel G A．Rainforest endophytes and bioactive pr oducts［J］．Critical Reviews in Biotechnology，2002，22（2）：315－333．

［5］ Harper J K，Arif A M，Ford E J．Pestacin：a l，3－dihydro isobenzof uran from Pestalotiopsis microspora possessing antioxidant and anti mycotic activities［J］．Tetrahedr on，2003，59（14）：2471－2476．

［6］ 江曙，陳代杰，陶金華，等．植物內生菌及其代謝產物的藥學研究進展［J］．中國生化藥物雜志，2008，29（6）：424－426．

［7］ 王金發．微生物學實驗［M］．北京：科學出版社，2004．

［8］ 江曙，陳代杰，戈梅，等．藥用植物內生真菌抗菌活性的篩選［J］．藥物生物技術，2006，13（5）：351－354．

［9］ 江曙，陳代杰，戈梅，等．藥用植物內生真菌對3種農作物病原真菌的拮抗作用［J］．江蘇農業科學，2008（1）：82－84．

［10］Ar nold A E，Mejia L C，Kyllo D，et al．Fungal endophyte li mit pat hogen da mage in a tr opical tree［J］．Proc Natl Acad Sci，2003，100：15649－15654．

［11］江曙，錢大瑋，段金廒，等．植物內生菌與道地藥材的相關性研究［J］．中草藥，2008，39（8）：1268－1272．

［12］Schulz B，Boyle C，Draeger S，et al．Endophytic f ungi：a source of novel biologically active secondary metabolites［J］．Mycol Res，2002，106（9）：996－1004．

［13］Kelemu S，Cardona C，Segura G．Anti microbial and insecticidal protein isolated from seeds of Clitoria ter natea，a tr opical forage legu me［J］．Plant Physiology and Biochemistry，2004，42：867－873．

［14］Strobel G A，Miller R V，Martinez－Miller C，et al．Cryptocandin，a potent antimycotic from the endophytic fungus Cr yptosporiopsis cf．quercina［J］．Mcrobiology，1999，145：1919－1926．

［15］Li J Y，Str obel G A，Harper J，et al．Cryptocin，a potent tetramic acid anti mycotic fro m the endophytic f ungus Cr yptosporiopsis cf．quercina［J］．Or g Lett，2000，2（6）：767－770．

［16］Geraldo H S，Helder L T，Maria C M Y．Cadinane sesquiterpenoids of Phomopsis cassiae，an endophytic fungus associated with Cassia spectabilis（Leguminosae）［J］．Phytochemistry，2006，67：1964－1969．